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Molecular and cultivation-based analyses of nitrifying communitites from mesophilic and thermophilic environments

Schuster, Nathalie (2010) Molecular and cultivation-based analyses of nitrifying communitites from mesophilic and thermophilic environments.
Diplomarbeit, University of Vienna. Fakultät für Lebenswissenschaften
BetreuerIn: Wagner, Michael

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DOI: 10.25365/thesis.9096
URN: urn:nbn:at:at-ubw:1-29716.39068.558463-0

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Abstract in English

Nitrification is a key part of the global nitrogen cycle and until recently was thought to be catalyzed only by two distinct groups of microorganisms, ammonia-oxidizing bacteria (AOB) and nitrite-oxidizing bacteria (NOB). However, the recent detection of ammonia-oxidizing archaea (AOA) in various terrestrial and marine habitats changed the view of the potential key players in nitrogen cycling. For functional and phylogenetic analysis of nitrifying microorganisms, the genes for the key metabolic enzyme of ammonia-oxidizing microorganisms (AOM), ammonia monooxygenase (Amo), and of NOB, nitrite-oxidoreductase (Nxr) are used as markers. In this study, the physiology of the moderately thermophilic chemoautotrophic AOA “Candidatus Nitrososphaera gargensis”, a member of the soil group I.1b of crenarchaeota, was investigated for potential mixotrophic growth using microautoradiography (MAR). Since mesophilic crenarchaeota are very abundant and possibly are capable of mixotrophic or heterotrophic growth, studies suggest that potential alternative metabolisms and growth strategies for mesophilic crenarchaeota have to be considered. Unfortunately, only a dead control was performed for bicarbonate, which showed a positive MAR signal. Therefore it is impossible to tell whether MAR signals resulted from substrate adsorption on the cell surface or from incorporation of substrates. Additionally, the nitrifying thermophilic enrichment culture of “Candidatus Nitrososphaera gargensis”was screened for contaminants. The aim was to identify contaminants and use this knowledge also to optimize cultivation strategies. Former MAR experiments identified the contaminants as heterotrophs with a rod-shaped morphology, and one contaminant already has been identified as a putative AOB. One new member of the contaminating population could be identified by its 16S rRNA sequences. Despite several attempts, it was not possible to detect other contaminants in the enrichmentby the 16S rRNA approach, and DGGE or T-RFLP. This is in agreement with other analysis, such as metagenomics. To proof autotrophic growth of the putative AOB, stable isotope probing with labeled bicarbonate and Raman microscopic analysis were performed. However, no labeling could be detected, suggesting that the incubation time was too short to detect labeling via Raman spectroscopy or that “putative AOB”are not able to oxidize ammonia. Furthermore, in order to find novel nitrifying microorganisms, enrichment cultures with soil and sludge from a WWTP were performed. No nitrifiers could be enriched, since despite antibiotics cultures were rapidly overgrown by fungi. In a second attempt to enrich nitrifying microorganisms, biofilm growing on filter balls from an aquarium pool in the “Haus des Meeres”was used as inoculum. It was possible to amplify bacterial and archaeal 16S rRNA genes as well as the functional genes amoA and nxrB from the biofilm. In addition, decrease of ammonia and nitrite could be observed in the enrichments. In none of the cultures high numbers of archaea could be detected. No known AOB could be identified, however, in some cultures Nitrococcus mobilis, a member of NOB, was detected. A clone library and sequence analysis confirmed that the enriched NOB were indeed 100% similar on 16S rRNA level to the isolated Nitrococcus mobilis. However, in other active cultures no NOB could be detected and in clone libraries no 16S rRNA genes of nitrifiers were found, except for one culture, in which three clones were most similar to Nitrospira marina from “sublineage IV”of the genus Nitrospira. In order to show autotrophic growth of Nitrococcus mobilis on a single-cell level, a culture that was incubated with 13Clabeled bicarbonate was investigated using Raman microscopy. Finally, Raman-FISH analysis provided proof of autotrophic growth of Nitrococcus mobilis. Taken together, the obtained results show that biofilm from aquarium water provided a good sample for enrichments of nitrifying microorganisms and that in some cultures Nitrococcus mobilis was successfully enriched. Nitrite-oxidizing cultures, in which no NOB could be identified, possibly contained only a very low amount of nitrifiers or harbored new microorganisms involved in nitrification. Another plausible explanation is that NOB attached to the glass surface of the incubation flasks and were overlooked. The printed version of the diplma thesis contains a Multimediabeilage (CD) with measuring data, which are now attached at the end of the thesis.

Schlagwörter in Englisch

nitrification / ammonia-oxidizing bacteria / nitrite-oxidizing bacteria / thermophilic ammonia-oxidizing archaea / microautoradiography / heterotrophy / autotrophy / Raman-microspectroscopy / Raman-FISH / cultivation of nitrifiers

Abstract in German

Nitrifikation stellt einen Schlüsselprozess des globalen Stockstoffkreislaufes dar und wird von zwei verschiedenen Gruppen von Mikroorganismen katalysiert: ammoniak-oxidierenden Bakterien (AOB) und nitrit-oxidierenden Bakterien (NOB). Die kürzliche Entdeckung von ammoniak-oxidierenden Archaeen (AOA) in diversen terrestrischen und marinen Habitaten veränderte das Bild der potentiell beteiligten Mikroorganismen im Stickstoffkreislauf. Das metabolische Schlüsselenzym der ammoniak-oxidierenden Mikroorganismen (AOM) stellt die Ammoniak Monooxygenase (Amo) dar, und jenes der NOB die Nitrit Oxidoreduktase (Nxr). Amo und nxr Gene werden zur funktionellen und phylogenetischen Analyse von nitrifizierenden Mikroorganismen als Markergene eingesetzt. In dieser Studie wurde die Physiologie des moderat thermophilen chemoautotrophen AOA “Candidatus Nitrososphaera gargensis”, einem Mitglied der Gruppe I.1b der Crenarchaeota, auf potentielles mixotrophes Wachstum mittels Mikroautoradiographie (MAR) getestet. Mesophile Crenarchaeoten sind sehr abundant und es gibt Hinweise auf ihr mixotrophes oder heterotrophes Wachstum, weshalb diverse Studien alternative Metabolismen und Wachstumsstrategien mesophiler Crenarchaeoten in Betracht ziehen. Bedauerlicherweise wurde in der Bicarbonat-Totkontrolle des Experiments ein positives MAR Signal beobachtet und für die weiteren verwendeten Substrate keine jeweils eigene Totkontrolle vorbereitet. Daher war es unmöglich zu unterscheiden, ob die MAR Signale aus der Adsorption der Substrate an die Zelloberfläche oder aus der Inkorporation der Substrate in die Zelle resultierten. Zusätzlich sollten die bakteriellen Begleitorganismen in der nitrifizierenden, thermophilen Anreicherung von “Candidatus Nitrososphaera gargensis” identifiziert und nachgewiesen werden, unter anderem um die Kultivierungsstrategie verbessern zu können. Früherdurchgeführte MAR Experimente gaben bereits Hinweise auf heterotrophe Bakterien mit stäbchenförmiger Morphologie. Ein Kontaminant war bereits vor der Studie als putativer AOB identifiziert worden. Im Laufe der Arbeit konnte ein weiterer Kontaminant anhand seiner 16S rRNA Sequenz identifiziert werden. Trotz mehrfacher Ansätze und Versuche war es nicht möglich, die Identität weiterer Kontaminanten anhand des 16S rRNA Ansatzes und mit Fingerprint-Methoden wie DGGE und T-RFLP in der Anreicherung zu bestimmen. Dieses Ergebnis wurde auch durch metagenomische Analyse der Anreicherung unterstützt. Um autotrophes Wachstum der putativen AOB nachzuweisen, wurden Zellen mit isotopenmarkiertem Bicarbonat inkubiert. Die Inkubationen wurden mittels Raman- Mikrospektroskopie untersucht und ausgewertet. Da keine markierten Zellen entdeckt wurden ist es möglich, dass die Inkubation der AOB mit stabilen Isotopen zu kurz war um markierte Zellen mittels Raman-Mikrospektroskopie zu detektieren, oder, dass die “putative AOB” kein Ammoniak oxidieren können. Ein zweiter wichtiger Teil der Arbeit beinhaltete den Versuch, neue nitrifizierende Mikroorganismen aus verschiedenen Umweltproben anzureichern. Dazu wurden Kulturen mit Erde und Klärschlamm angesetzt. Allerdings konnten keine Nitrifikanten angereichert werden, da trotz der Zugabe von Antibiotika die Kulturen nach kurzer Zeit von Pilzen überwachsen waren. In einem weiteren Versuch nitrifizierende Mikroorganismen anzureichern wurde Biofilm, der auf den Filteranlagen eines Aquariums des Haus des Meeres wuchs, als Inokulum für die Anreicherungskulturen verwendet. Hier konnten sowohl bakterielle und archaeelle 16S rRNA Gene als auch die funktionellen Gene amoA und nxrB amplifiziert werden. Außerdem wurde in den Anreicherungen ein Verbrauch von Ammoniak und Nitrit beobachtet. In keiner der Kulturen waren Archaeen abundant. Weiters konnten keine bekannten AOB gefunden werden, in einigen Kulturen wurde jedoch Nitrococcus mobilis, ein Nitrit Oxidierer, identifiziert. Die Erstellung einer Klonbibliothek und anschließende Sequenzanalysen bestätigten die Identität der angereicherten NOB als Nitrococcus mobilis basierend auf einer 16S rRNA Ähnlichkeit von 100%. Allerdings konnten in anderen Kulturen, die ebenfalls aktiv Nitrit konsumierten, weder NOB identifiziert, noch ihre 16S rRNA Gene in den dazugehörigen Klonbibliotheken gefunden werden. Eine Ausnahme stellten drei Klone dar, die in einer Kultur gefunden wurden und große Ähnlichkeit zu Nitrospira marina aus der Untergruppe IV des Genus Nitrospira aufwiesen. Um autotrophesWachstum von Nitrococcus mobilis auf Einzelzellebene nachzuweisen, wurden die Zellen mit 13C-markiertem Bicarbonat inkubiert und anschließend mittels Raman-Mikrospektroskopie untersucht. Mit Raman-FISH konnte schließlich autotrophes Wachstum von Nitrococcus mobilis gezeigt werden. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse dieser Kultivierungen, dass Biofilm aus Aquarium-Filteranlagen eine geeignete Umweltprobe für Anreicherungen von nitrifizirenden Mikroorganismen darstellte und in einigen Kulturen Nitrococcus mobilis erfolgreich angereichert werden konnte. Mikrobielle Biofilme in Kulturen, die Nitrit oxidierten, in denen jedoch keine NOB identifiziert werden konnten, bestanden möglicherweise nur zu einem sehr geringen Anteil aus Nitrifikanten oder aber enthielten neue und unbekannte nitrifizierende Mikroorganismen. Eine andere plausible Erklärung dafür, dass keine NOB gefunden werden konnten, ist die Möglichkeit, dass sich die NOB an die Wände der Glasflaschen, in denen sie inkubiert wurden, anlagerten und somit übersehen wurden. Die Druckversion der Diplomarbeit enthält eine Multimediabeilage (CD) mit Messdaten, die hier am Ende der Diplomarbeit angehängt sind.

Schlagwörter in Deutsch

Nitrifikation / ammoniak-oxidierende Bakterien / nitrit-oxidierende Bakterien / thermophile ammoniak-oxidierende Archaea / Mikroautoradiographie / Heterotrophie / Autotrophie / Raman-Mikrospektroskopie / Raman-FISH / Kultivierung von Nitrifikanten

Item Type: Hochschulschrift (Diplomarbeit)
Author: Schuster, Nathalie
Title: Molecular and cultivation-based analyses of nitrifying communitites from mesophilic and thermophilic environments
Umfangsangabe: 175 S.
Institution: University of Vienna
Faculty: Fakultät für Lebenswissenschaften
Publication year: 2010
Language: eng ... Englisch
Supervisor: Wagner, Michael
Assessor: Wagner, Michael
Classification: 42 Biologie > 42.30 Mikrobiologie
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie
AC Number: AC08167653
Item ID: 9096
(Das PDF-Layout ist ident mit der Druckausgabe der Hochschulschrift.)

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