Universitätsbibliothek Wien

Drug resistance and virulence of the human fungal pathogen Candida glabrata

Schwarzmüller, Tobias (2009) Drug resistance and virulence of the human fungal pathogen Candida glabrata.
Dissertation, Universität Wien. Fakultät für Lebenswissenschaften
BetreuerIn: Kuchler, Karl

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URN: urn:nbn:at:at-ubw:1-29131.41478.956453-4
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Abstract in Englisch

Candida glabrata is an opportunistic human fungal pathogen. It is the second most frequent cause of Candida-derived infections after Candida albicans. Infection with either one of the two pathogenic fungi can result in diseases ranging from superficial cutaneous or mucosal to life-threatening systemic infections in immunocompromised individuals. Welldocumented virulence attributes of C. glabrata are the inherent reduced azole susceptibility and a large repertoire of adhesin genes, which are regulated by transcriptional silencing. However, the molecular basis of C. glabrata antifungal drug resistance and additional virulence factors is not well understood. The combination of fungal genomics and large-scale phenotypic profiling of deletion mutants represents a powerful approach to identify new factors contributing to fungal virulence. For this doctoral thesis, the C. glabrata genome sequence data were used to select genes with non-essential functional orthologues of the non-pathogenic yeast Saccharomyces cerevisiae. Based on this selection, a large-scale reverse genetics approach was initiated to identify novel genes implicated in C. glabrata pathogenicity and drug resistance. A bar-coded C. glabrata deletion strain collection was engineered comprising some 500 single gene deletion mutants affected in signaling functions, regulation of gene expression, cell wall biogenesis, transport processes, drug resistance, stress response and metabolism. Phenotypic profiling identified a total of 103 C. glabrata genes involved in resistance to cell wall-perturbing compounds, antifungal drugs, heat stress, osmosensitivity, metal ion or detergent tolerance, growth on minimal medium and phenotypic switching. Host-pathogen interaction related phenotypes were analyzed using an in vitro assay detecting reactive oxygen species (ROS). Screening for ROS elicited by primary mouse bone-marrow-derived macrophages co-incubated with C. glabrata mutants resulted in the identification of mutants lacking cell wall-related genes. Taken together, numerous deletion strains showed growth phenotypes different from known phenotypes of S. cerevisiae. For example, genes were identified, which have previously not been associated with sensitivity to the glucan synthase inhibitor Caspofungin. This also included C. glabrata genes, which do not have orthologues in baker’s yeast. The function of CgCBK1 gene has been studied in more detail, because it exhibits severe cell separation defects. Transcriptional profiling of this mutant showed differential expression of a distinct set of genes with cell wall-associated functions. In summary, the generated C. glabrata gene deletion strain collection is one of the largest collections of fungal deletion strains in the world and represents a powerful tool to study the virulence of a human fungal pathogen. Future studies based on the in vitro results will exploit the signature-tag strategy to identify novel virulence-associated factors in vivo.

Schlagwörter in Englisch

Candida glabrata / drug resistence / virulence / gene deletion strain library / drug screening / host pathogen interaction / molecular barcode / fusion PCR

Abstract in Deutsch

Candida glabrata ist ein opportunistischer humanpathogener Pilz. Nach Candida albicans stellt er die zweithäufigste Ursache für Pilzerkrankungen durch Candida spp. dar. Die Infektion mit C. glabrata kann zu Erkrankungen der Haut oder der Schleimhäute bis hin zur lebensbedrohlichen systemischen Infektion bei immunsupprimierten Patienten führen. Hauptvirulenzfaktoren von C. glabrata sind sowohl eine erhöhte natürliche Resistenz gegen Azolverbindungen, als auch eine große Anzahl verschiedener Adhesine. Welche molekularen Mechanismen diesen Virulenzfaktoren zu Grunde liegen, ist größtenteils noch unbekannt. Genomik und phänotypische Analyse von Deletionsmutanten stellen einen Ansatz dar, um neue Virulenzfaktoren pathogener Pilzen zu identifizieren. Für diese Doktorarbeit wurden C. glabrata Sequenzdaten verwendet, um nicht essentielle, zu Saccharomyces cerevisiae homologe Gene auszuwählen. Mit Hilfe eines revers-genetischen Ansatzes wurde dann eine Kollektion von Deletionsmutanten erstellt. Diese Stammbibliothek diente als Ausgangsbasis für die phänotypische Analyse der Mutanten zur Identifizierung neuer Gene, die die Pathogenität und Azolresistenz von C. glabrata beeinflussen. Insgesamt umfasst die Kollektion 476 einzelne, mit einem molekularen Barcode versehene Stämme, bei denen Signaltransduktionsgene, Transkriptionsfaktoren, Zellwandbiosynthesegene, Resistenzgene und C. glabrata spezifische Gene deletiert wurden. Es wurden 103 Mutanten identifiziert, die Wachstumsdefekte unter Zellwandstress, in Gegenwart von Antimykotika, bei Temperaturstress, Osmolaritätsänderungen, Kontakt mit Detergenzien oder beim Wachstum auf Minimalmedium aufzeigen. Die Interaktion zwischen Makrophagen und C. glabrata wurde in vitro durch die Detektion von reaktiven Sauerstoffmolekülen (ROS) getestet. Dadurch wurden mehrere Zellwandmutanten entdeckt, die eine erhöhte ROS-Produktion durch die Makrophagen verursachen. Mehrere Deletionsstämme zeigten Phänotypen, die sich von den bekannten S. cerevisiae Mutanten unterscheiden. Es konnten Gene identifiziert werden, die noch nicht mit Caspofunginsensitivität assoziiert worden sind. Darunter befanden sich auch Gene, die keine Orthologe in S. cerevisiae haben. CgCBK1 wurde aufgrund des schweren Zellteilungsdefekts näher charakterisiert. Die Transkriptionsanalyse des Cgcbk1Δ Stammes zeigte, dass bestimmte Zellwandgene unterschiedlich exprimiert werden. Diese Sammlung von Deletionsstämmen ist eine der größten weltweit und ist somit von sehr großem Nutzen für das Studium der Pathogenität von C. glabrata. Zukünftige in vivo Experimente werden unter Ausnützung der integrierten „molekularen Barcodes“ die Identifizierung neuer Virulenzfaktoren ermöglichen.

Schlagwörter in Deutsch

Candida glabrata / Resistenz / Virulenz / Erstellung einer Bibliothek von Gendeletionsstämmen / Screening / Wirt-Pathogen Interaktion / molekularer Barcode / fusion PCR

Dokumentenart: Hochschulschrift (Dissertation)
AutorIn: Schwarzmüller, Tobias
Titel: Drug resistance and virulence of the human fungal pathogen Candida glabrata
Umfangsangabe: 197 S. : Ill., graph. Darst.
Institution: Universität Wien
Fakultät: Fakultät für Lebenswissenschaften
Publikationsjahr: 2009
Sprache: eng ... Englisch
BetreuerIn: Kuchler, Karl
BeurteilerIn: Weig, Michael
2. BeurteilerIn: de Groot, Piet
Klassifikation: 42 Biologie > 42.20 Genetik
42 Biologie > 42.30 Mikrobiologie
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie
AC-Nummer: AC07452203
Dokumenten-ID: 6656
(Das PDF-Layout ist ident mit der Druckausgabe der Hochschulschrift.)

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