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Neurotrophic dependency of sensory neurons in a co-culture model of porcine DRGs and human skin cells

Falkner, Susanne Martina (2009) Neurotrophic dependency of sensory neurons in a co-culture model of porcine DRGs and human skin cells.
Diplomarbeit, University of Vienna. Zentrum für Molekulare Biologie
BetreuerIn: Huck, Sigismund
Gesperrt bis: 30 June 2010

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URN: urn:nbn:at:at-ubw:1-29174.76844.437059-5

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Abstract in English

In this work, the local influence of dermal and epidermal skin cells on sensory afferent nerve growth was investigated using a novel in-vitro co-culture system of porcine dorsal root ganglion cells (DRGs) and human primary skin cells. The co-culture system allows for the cultivation of cell somata and peripheral neuronal processes in spatially separated compartments that are liquid-impermeable. In accordance with the in-vivo situation, only the axonal processes of sensory neurons were co-cultivated with dermal and epidermal skin cells in the „peripheral“ compartment. This approach allows to study the neuronal cutaneous network in-vitro. In a first attempt, the co-culture system was established and characterized. The sensitivity of the system in response to the neurotrophic factor human NGFβ was examined. Recombinant huNGFβ induced a dose-dependent outgrowth of peripheral sensory fibers in a range between several pg/mL to 10 ng/mL. The major increase in cumulative peripheral neurite length (CPNL) was detected between day 6 and 10 of cells in culture. Subsequently, subtypes of peripheral sensory fibers grown in response to huNGFβ were characterized and quantified via immunofluorescent staining for the nociceptive, peptidergic markers calcitonin-gene-related-peptide (CGRP) and receptor tyrosine kinase TrkA, the non-peptidergic marker Isolectin B4 (IB4) and the vanilloid receptor TRPV1. IB4 and CGRP expressions were prevailing with 63,8 % and 54,7 %, followed by TrkA with 17,8 % and TRPV1 with 4,6 % of CPNL, thus confirming the nociceptive sensory phenotype of the grown fibers. The functionality of the cultured sensory neurons was verified via unspecific stimulation with high potassium (50mM) and specific stimulation with the TRPV1 agonist capsaicin (CPS) and inhibition with the antagonist capsazepine (CPZ), respectively. Unspecific and specific stimulation of the somata in the middle compartment resulted in an efferent release of the neuropeptide CGRP in the peripheral side compartment. The CPS mediated stimulation of TRPV1 was successfully inhibited by the receptor specific antagonist CPZ, further emphasizing the functionality of the cultured neurons. Finally, the neurotrophic effects of keratinocytes and fibroblasts on peripheral sensory fiber outgrowth was investigated. Both cell types were sufficient to induce substantial sensory fiber outgrowth. Surprisingly, keratinocyte mediated CPNL exceeded the outgrowth mediated by recombinant huNGFβ. Additionally, co-application of an anti-NGFβ antibody decreased fibroblast mediated growth to negative control level, whereas keratinocytes mediated growth was only reduced to 42,9 %. These results indicate that fibroblasts induce fiber growth mainly via NGF, whereas keratinocytes produce at least one additional soluble factor that accounts for the NGF independent fiber growth. Comparison of keratinocyte mediated outgrowth with and without anti-NGFβ antibody revealed no difference in CPNL values at day 4 and 6. As neuronal fibers usually reached the keratinocyte layer at day 6, NGF seems not necessary for neurites to enter the side compartment, extend and reach the keratinocytes. NGF may rather play a role for the increase in length between day 6 and 10, consistent with the reduction of 57,1 % of CPNL without NGF. Further consistent with this hypothesis was the analysis of fiber morphology. Neurites stimulated by keratinocytes exhibited extensive branching and frequently wrapped around individual cells. On the contrary, fibroblasts mediated fibers of more unbranched and straight phenotype.

Schlagwörter in Englisch

co-culture model / dorsal root ganglion cells / growth factors / NGF / keratinocytes / fibroblasts / sensory neurons / CGRP / peripheral neuronal fibers

Abstract in German

Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Einfluss von dermalen und epidermalen Hautzellen auf das Wachstum von peripheren sensorischen Nerven in einem neuen in-vitro Kokultur-Modell untersucht. In diesem Modell werden neuronale Zellkörper und ihre peripheren Fortsätze örtlich getrennt in separaten, flüssigkeitsdichten Kammern kultiviert. Entsprechend den Gegebenheiten in-vivo, wurden dermale und epidermale Hautzellen ausschließlich mit den neuronalen Fortsätzen in der „peripheren“ Seitenkammer kultiviert. Dieses spezielle Setup ermöglicht die Untersuchung des peripheren neuronalen Netzwerks in der Haut in-vitro. Im ersten Schritt der Arbeit wurde das Kokultur-Modell etabliert und charakterisiert. Die Sensitivität des Systems auf neurotrophe Faktoren wurde mittels humanem NGFβ analysiert. Rekombinantes huNGFβ induzierte dosis-abhängiges peripheres Neuritenwachstum in einem Bereich von wenigen pg/mL bis hin zu 10 ng/mL. Die größte Zunahme an der gesamten peripheren Neuriten Länge (cumulative peripheral neurite length, CPNL) wurde zwischen dem sechsten und zehnten Tag der Kultivierung beobachtet. Die von huNGFβ induzierten peripheren Fortsätze wurden im Anschluss mittels Immunfluoreszenzfärbung charakterisiert und quantifiziert. Detektiert wurden die Marker für sensorische, nozizeptive, peptiderge Neurone Calcitonin-gene-related-peptide (CGRP) und Receptor tyrosine kinase TrkA, der sensorische, nozizeptive, nicht-peptiderge Marker Isolectin B4 (IB4) und der Vanilloid Rezeptor TRPV1. Die Espression von IB4 und CGRP war mit 63,8 % und 54,7 % am stärksten detektiertbar, gefolgt von TrkA mit 17,8 % und TRPV1 mit 4,6 %. Der positive Nachweis dieser Marker bestätigt die Präsenz von sensorischen, nozizeptiven Fasern im vorliegenden Modell. Dabei kann zum ersten Mal eine quantitative Aussage über das Expressionsmuster dieser Marker in den peripheren Fasern, abhängig von den Wachstumsbedingungen gemacht werden. Die Funktionalität der kultivierten Neuronen wurde mittels unspezifischer Stimulation mit 50 mM Kalium und spezifischer Stimulation mit dem TRPV1 Agonisten Capsaicin (CPS), sowie Inhibition mit dem Antagonisten Capsazepin (CPZ) bestätigt. Sowohl unspezifische als auch spezifische Stimulation der neuronalen Somata in der Mittelkammer bewirkten die efferente Ausschüttung des Neuropeptids CGRP in der peripheren Seitenkammer. Die Stimulation von TRPV1 mittels CPS wurde erfolgreich durch den Rezeptor-spezifischen Antagonisten CPZ inhibiert und bestätigt erneut die Funktionalität der kultivierten Neurone. Schließlich wurde die neurotrophe Wirkung von Fibroblasten und Keratinozyten auf das Wachstum der peripheren neuronalen Fortsätze untersucht. Beide Zelltypen induzierten erhebliches Neuritenwachstum, wobei Keratinozyten sogar höhere CPNL Werte erzielte als recombinantes huNGFβ. Bei gleichzeitiger Anwendung eines anti-NGFβ Antikörpers wurde das von Fibroblasten induzierte Wachstum auf Kontrollniveau reduziert, wohingegen Keratinozyten vermitteltes Wachstum nur auf 42,9 % verringert wurde. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Fibroblasten induziertes Neuritenwachstum größtenteils durch NGF vermittelt wird. Keratinozyten scheinen hingegen zumindest einen zustätzlichen, sekretierten Faktor zu produzieren, der für das verbleibende, NGF unabhängige Wachstum verantwortlich ist. Im Vergleich zwischen Keratinozyten vermitteltem Neuritenwachstum mit und ohne anti-NGFβ Antikörper, zeigte sich keinerlei Unterschied in den CPNL Werten am Tag 4 und 6. Da Neurite üblicherweise die Keratinozytenschicht am Tag 6 erreichen, scheint NGF nicht notwendig für das Auswachsen und Erreichen der Keratinozyten zu sein. NGF spielt möglicherweise eine größere Rolle im Längenwachstum zwischen Tag 6 und 10, wo sich ein Unterschied von minus 57,1 % ohne NGF manifestiert. Mit dieser Annahme gehen auch Beobachtungen der Morphology der Neurite konform. Keratinozyten vermittelten Fortsätze mit einem hohen Grad an Verzweigungen, die häufig einzelne Zellen umwickelten. Hingegen wiesen Fibroblasten induzierte Fasern einen geradlinigen, gering verzweigten Phänotyp auf.

Schlagwörter in Deutsch

Kokultur Modell / Dorsalganglien / Wachstumsfaktoren / NGF / Keratinozyten / Fibroblasten / Sensorische Neurone / CGRP

Item Type: Hochschulschrift (Diplomarbeit)
Author: Falkner, Susanne Martina
Title: Neurotrophic dependency of sensory neurons in a co-culture model of porcine DRGs and human skin cells
Umfangsangabe: 100 S. Ill., graph. Darst.
Institution: University of Vienna
Faculty: Zentrum für Molekulare Biologie
Publication year: 2009
Language: eng ... Englisch
Supervisor: Huck, Sigismund
Assessor: Huck, Sigismund
Classification: 42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie
44 Medizin > 44.90 Neurologie
42 Biologie > 42.15 Zellbiologie
AC Number: AC08156877
Item ID: 5644
(Das PDF-Layout ist ident mit der Druckausgabe der Hochschulschrift.)

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