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Evaluation of reporter constructs for Wnt, Notch and Hedgehog pathways

Peric, Katarina (2019) Evaluation of reporter constructs for Wnt, Notch and Hedgehog pathways.
Diplomarbeit, University of Vienna. Fakultät für Lebenswissenschaften
BetreuerIn: Ogris, Manfred

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DOI: 10.25365/thesis.55975
URN: urn:nbn:at:at-ubw:1-22744.24300.403760-8

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Abstract in English

Cancer is still one of major death causes worldwide. Developmental signalling pathways such as Wnt, Notch and Hedgehog, usually involved in tissue homeostasis and embryonic devel-opment, are found to be deregulated in many types of cancer. Understanding how these pathways are coordinated, how they interplay and how they are altered in cancer provides more insight in the process of oncogenesis and subsequently the possibility for development of new and highly specific treatment strategies of cancer. The major topic of this thesis was to assess function of our reporter construct 3P-TOP which dynamically visualizes activity of Wnt, Notch and Hedgehog pathways. The reporter con-struct comprises three pathway-dependent promoters (CBF, TOPFlash, hPTCH1) driving the expression of distinct fluorescent proteins (tdTomato, iRFP, mTurquoise2). In addition, con-stitutive active CMV promoter drives expression of EGFP which is therefore always expressed providing information about transfection efficiency. Our reporter construct was transfected into lung cancer cell line A549 and promoters were induced upon addition of pathway spe-cific activators. Increase in fluorescence signal and thus pathway activity was measured via flow cytometry. However, in fluorescence assay only activation of Notch pathway could be achieved. Hence, all three pathway-dependent promoters (CBF, TOPFlash, hPTCH1) were tested separately for their inducibility in fluorescence assay (CBF) and bioluminescence assay (TOPFlash and hPTCH1). Bioluminescence assay was performed due to higher sensitivity and enzymatic amplification of Firefly luciferase compared to fluorescent proteins. Finally, our results revealed that Wnt and Notch dependent promoters (CBF and TOPFlash) could be in-duced upon activator treatment while testing of Hedgehog dependent promoter (hPTCH1) showed no reproducible results. In future experiments, a new reporter construct will be gen-erated containing a different Hedgehog promoter and luciferases reporter genes instead of fluorescent proteins. Reporter gene constructs offer the opportunity to study function of e.g. pathway-specific promoters from certain signalling pathways often deregulated in cancer. With this knowledge, new treatment approaches can be developed providing cancer patients higher survival chances and lower relapse rate.

Schlagwörter in Englisch

Wnt / Notch / Hedgehog

Abstract in German

Krebs ist weiterhin eine der Haupttodesursachen weltweit. Signaltransduktionswege wie z.B. Wnt, Notch und Hedgehog, welche normalerweise an Gewebshomöostase und in der Embryonalentwicklung beteiligt sind, sind oftmals in vielen Arten von Krebs dereguliert. Das Verständnis darüber wie diese Signaltransduktionswege koordiniert sind, wie sie miteinander wechselwirken und inwiefern sie in Krebs dereguliert sind, bietet uns einen größeren Einblick in die Karzinogenese und die Möglichkeit, neue, hoch-spezifische Behandlungsstrategien gegen Krebs zu entwickeln. Eines der Hauptziele dieser Arbeit war, die Funktion des Reporterkonstrukts 3P-TOP zu testen, welches die Aktivität der drei oben genannten Signaltransduktionswege dynamisch visualisieren soll. Das Reporterkonstrukt besteht aus drei Promotoren (CBF, TOPFlash, hPTCH1), welche Signaltransduktionsweg-abhängig aktiviert werden, und aus Genen welche für Fluorophore kodieren. Zusätzlich enthalten ist ein konstitutiv aktiver Promotor (CMV), der die Expression von EGF vorantreibt, welches daher immer exprimiert wird und Aufschluss über die Transfektionseffizienz bietet. Unser Reporterkonstrukt wurde in die Lungenkarzinom-Zelllinie A549 transfiziert und durch Zugabe von Signaltransduktions-abhängigen Aktivatoren induziert. Eine Erhöhung des Fluoreszenzsignals, welches mit der Aktivierung eines Signaltransduktionsweges korreliert, wurde mittels Durchflusszytometrie vermessen. Allerdings konnte im Fluoreszenzassay nur der Notch Signaltransduktionsweg aktiviert werden. Aus diesem Grund wurden alle drei Signaltransduktionsweg-abhängigen Promotoren (CBF, TOPFlash, hPTCH1) separat auf ihre Induzierbarkeit in zwei verschiedenen Assays getestet: im Fluoreszenzassay (CBF) und im Biolumineszenzassay (TOPFlash, hPTCH1). Der Biolumineszenzassay wurde aufgrund der höheren Sensitivität und enzymbedingten Signalamplifizierung der Glühwürmchen-Luciferase im Vergleich zu Fluoreszenzproteinen durchgeführt. Schlussendlich ergaben unsere Ergebnisse, dass die Wnt und Notch-abhängigen Promotoren (TOPFlash, CBF) mittels Zugabe von Aktivatoren induziert werden konnten. Im Vergleich dazu konnte der Hedgehog-abhängige Promotor (hPTCH1) nicht induziert werden und lieferte keine reproduzierbaren Ergebnisse. In zukünftigen Experimenten wird ein neues Reporterkonstrukt gebaut werden, dass einen anderen Hedgehog-abhängigen Promotor enthalten wird und Luciferasen als Reportergene anstelle von Fluoreszenzproteinen. Reportergenkonstrukte bieten die Möglichkeit, die Funktion von Promotoren zu testen wie z.B. Promotoren bestimmter Signaltransduktionswege, die in Krebs oftmals dereguliert sind. Mit diesem Wissen können neue Therapiestrategien gegen Krebs entwickelt werden, welche Krebspatienten eine höhere Überlebenschance und eine geringere Rückfallquote bieten könnten.

Schlagwörter in Deutsch

Wnt / Notch / Hedgehog

Item Type: Hochschulschrift (Diplomarbeit)
Author: Peric, Katarina
Title: Evaluation of reporter constructs for Wnt, Notch and Hedgehog pathways
Umfangsangabe: 67 Seiten : Illustrationen, Diagramme
Institution: University of Vienna
Faculty: Fakultät für Lebenswissenschaften
Studiumsbezeichnung bzw.
Universitätslehrgang (ULG):
Diplomstudium Pharmazie
Publication year: 2019
Language: eng ... Englisch
Supervisor: Ogris, Manfred
MitbetreuerIn: Sami, Haider
Assessor: Ogris, Manfred
Classification: 30 Naturwissenschaften allgemein > 30.00 Naturwissenschaften allgemein: Allgemeines
30 Naturwissenschaften allgemein > 30.99 Naturwissenschaften allgemein: Sonstiges
AC Number: AC15289836
Item ID: 55975
(Das PDF-Layout ist ident mit der Druckausgabe der Hochschulschrift.)

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