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Einfluss der Stabilität des siRNA-Antisense Strangs auf den Gene-Silencing Effekt nach rezeptorvermittelter Zellaufnahme

Stadlbauer, Mathias (2017) Einfluss der Stabilität des siRNA-Antisense Strangs auf den Gene-Silencing Effekt nach rezeptorvermittelter Zellaufnahme.
Diplomarbeit, University of Vienna. Fakultät für Lebenswissenschaften
BetreuerIn: Winkler, Johannes

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DOI: 10.25365/thesis.45620
URN: urn:nbn:at:at-ubw:1-20974.73273.328164-8

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Abstract in German

RNA-Interferenz stellt eines der attraktivsten Prinzipien für neue Therapieformen dar, da relativ einfach und zielgenau Gene posttranslational ausgeschaltet werden können, was neue Wege in der Behandlung von Erbkrankheiten, Viruserkrankungen und Krebs ebnet. Die Praxis zeigt jedoch ein anderes Bild aufgrund zahlreicher Hürden, welche den enzymatischen Abbau und hohe Clearance-Raten, off-target Effekte oder Immunreaktionen betreffen. Der unzureichende endosomale Escape stellt bisher eine der größten Hürden in der Anwendung von RNAi dar. Lösungsansätze wie Nanopartikel, Komplexe mit Polykationen und andere Carrier-Systeme sollen die Zellaufnahme verbessern. Eine Alternative bezieht sich auf chemischer Modifikation der siRNA. Im Rahmen dieser Arbeit wurde deshalb ein Set aus insgesamt 20 unterschiedlich modifizierter Antisense-Stränge generiert, die mit dem Sense-Strang vereint 20 siRNAs mit unterschiedlichen Eigenschaften gegen die mRNA der Luciferase ergeben. Modifikationen beziehen sich hauptsächlich auf Methylierungen der 2’-OH-Gruppe der Ribose sowie Phosphothioate des Backbones, wobei ausgewählte Stränge am 3’-Ende mit Cholesterin verknüpft wurden. Die siRNAs wurden im Zellversuch an stabil Luciferase transfizierten HeLa- und MCF-7-Zellen auf ihre Wirksamkeit getestet. Vollständig 2’-OH-Me- und/oder Phosphothioat-Modifikation resultierte in starkem Effektverlust, während 3’-Cholesterin und geringe Zahl an 2’-O- methylierten Nukleotiden geringeren Einfluss hatten. Hingegen führten bereits wenige 2’-OH-Modifikationen wie auch der Cholesterin-Rest zu signifikant höherer enzymatischer Stabilität, während Phosphothioate kaum Beitrag zur Stabilität der siRNA leisteten. Substanzen mit geringem Effektverlust bei gleichzeitig hoher Beständigkeit wurden als DARPin-Konjugate eingesetzt, welche EpCAM-vermittelt aufgenommen werden sollten. Dazu wurden vorrangig die 3’-Cholesterin- gekoppelten Antisense-Stränge herangezogen um den Einfluss auf erhöhten endosomalen Escape zu ergründen, aber keine der getesteten Substanzen verbesserte das Gene-Silencing verglichen mit dem unmodifizierten Antisense- Strang. Antisense-Modifikationen scheinen vielversprechend, da durch gezielte Auswahl modifizierter Nukleotide Stabilitätserhöhung bei geringem Effektverlust möglich ist. Modifizierte siRNAs können den Gene-Silencing Effekt verlängern, aber diesen nach rezeptorvermittelter Aufnahme in unseren Tests nicht verbessern.

Schlagwörter in Deutsch

RNA-Interferenz / Antisense-Modifikationen / DARPins / Oligonukleotidsynthese / Gelelektrophorese / Massenspektrometrie / Serumstabilität / Luciferase-Assay

Abstract in English

RNA-Interference is one of the most promising therapeutic principles, because it allows simple and precise post-translational gene knockdown, in which there is hope for treatment of genetic disorders, viral diseases and cancer. However, it is for a difficult task to put RNAi into practise as there are several barriers limiting its implementation. Problems that must be solved are enzymatic degradation and high clearance rates, off-target effects or immune reactions. To date, insufficient endosomal escape is one of the biggest limitations on the implementation of RNAi. Solution approaches like nanoparticles, complexes with polycations and other carrier systems therefore are aimed to improve cellular uptake. Another possibility is chemical modification of siRNAs. In scope of this work, a set of overall 20 individually modified antisense-strands was generated, which make up 20 variations of siRNAs, targeted against the luciferase-mRNA when combined with the sense-strand. Modifications mostly concern methylation of the ribose 2’-OH and a phosphorothioate backbone, whereas selected strands were coupled to cholesterol on the 3’-end. The processed siRNAs were examined on effectiveness in cell-culture experiments using stably Luc-transfected HeLa- and MCF-7-cells. Full 2’-O-Me and/or phosphorothioate modification resulted in strong reduction of gene silencing, while 3’-cholesterol attachment and limited numbers of 2’-O-Me nucleotides had lesser impact. On the other hand, even confined 2’-OH- modifications as well as the 3’-cholesterol attachment resulted in significantly higher enzymatic stability whereas phosphorothioate-backbones did not noticeably contribute to the siRNA’s stability. Substances, whose modification patterns showed small loss of efficacy and increased stability at the same time, were used as DARPin-conjugates for EpCAM-mediated cellular uptake. Primarily, the 3’- cholesterol-coupled antisense-strands were intended for that purpose to investigate the influence on enhancing endosomal escape, but none of the tested substances improved the gene silencing compared to the unmodified antisense strand. The use of modified antisense-strands is promising, hence a precise selection of modified nucleotides provides significant enhancement of the siRNA’s stability without losing too much of its knockdown efficacy. The modified siRNAs can prolong the silencing effect, but did not improve short-term gene silencing efficiency after receptor- mediated uptake in our test setting.

Schlagwörter in Englisch

RNA interference / antisense-modifications / DARPins / oligonucleotide synthesis / gel electrophoresis / mass spectrometry / serum stability / luciferase assay

Item Type: Hochschulschrift (Diplomarbeit)
Author: Stadlbauer, Mathias
Title: Einfluss der Stabilität des siRNA-Antisense Strangs auf den Gene-Silencing Effekt nach rezeptorvermittelter Zellaufnahme
Umfangsangabe: 74 Seiten : Illustrationen, Diagramme
Institution: University of Vienna
Faculty: Fakultät für Lebenswissenschaften
Studiumsbezeichnung bzw.
Universitätslehrgang (ULG):
Diplomstudium Pharmazie
Publication year: 2017
Language: ger ... Deutsch
Supervisor: Winkler, Johannes
Assessor: Winkler, Johannes
Classification: 44 Medizin > 44.42 Pharmazeutische Chemie
44 Medizin > 44.40 Pharmazie, Pharmazeutika
35 Chemie > 35.75 Nukleinsäuren
35 Chemie > 35.26 Massenspektrometrie
35 Chemie > 35.29 Chromatographische Analyse, Elektrophorese
35 Chemie > 35.71 Biochemische Methoden
AC Number: AC13664776
Item ID: 45620
(Das PDF-Layout ist ident mit der Druckausgabe der Hochschulschrift.)

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