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Comparison of the pro-apoptotic and anti-proliferative effects of two related CDK inhibitors

Walzi, Eva (2009) Comparison of the pro-apoptotic and anti-proliferative effects of two related CDK inhibitors.
Diplomarbeit, University of Vienna. Fakultät für Lebenswissenschaften
BetreuerIn: Heberle-Bors, Erwin
Gesperrt bis: 2 February 2010

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URN: urn:nbn:at:at-ubw:1-29867.93905.509366-2

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Abstract in English

Cell cycle progression is regulated by sequential and orchestrated activation of cyclin- dependent kinase (CDK)/cyclin complexes and additionally by cellular inhibitors of CDKs as well as by p53 protein, a product of a tumour suppressor gene. Deregulation of the cell cycle regulators as well as inactivation of intrinsic inhibitors of CDKs frequently occurring during malignant transformation constituted the rationale for development of pharmacological inhibitors of CDKs for therapy of cancers. In the present thesis three structurally related tri-substituted purines, namely Olomoucine (OLO), Roscovitine (ROSC), and Olomoucine II (OLO II), were used for treatment of tumour cells. Whereas the action of the two first inhibitors of CDKs on different cancer types in experimental approaches and clinical trials was previously described, that of the latter, a very recently synthesised compound, is actually unknown. These tri-substituted purines, most ATP-related have been shown to be non-genotoxic and only slightly cytotoxic. These traits confer them an advantage over conventional cytostatic drugs and predestine them for therapeutic application. In the thesis the efficacy of the CDK inhibitors on two aggressive human cancer cell lines (HL-60 promyelocytic leukaemia cells and HeLa cervical carcinoma cells) and normal human fibroblasts (MRC-5 cells) was studied. Furthermore, to evaluate the role of the two in malignancy most frequently mutated genes, TP53 and RAS, were tested in an appropriate experimental model. For this purpose cell clones overexpressing temperature-sensitive (ts) p53135Val mutant alone or in combination with mutated c-Ha-Ras, were used. The temperature sensitive p53135Val mutant offers the possibility to evaluate under the same genetic background whether the functional status of p53 (wild-type versus mutant) plays any role in the susceptibility of tumour cells to the anti-cancer therapy. Moreover, comparison of the outcomes of the treatment of immortalized cells (cells overexpressing p53135Val) and transformed cells (cells overexpressing p53135Val + c-Ha Ras) allows to evaluate the role constitutive activation of pro-survival genes like RAS in the regulation of the sensitivity of cancer cells to growth-inhibitory and apoptosis-promoting drugs. TP53 and RAS, the two genes most frequently mutated during malignant transformation, seem to determine the sensitivity of cancer cells to anti-cancer treatment and therefore, may be used as targets for therapeutic approaches. TP53, encoding p53 tumour suppressor protein, called the ‘guardian of the genome’ (Lane, 1992) has numerous activities in cells. It is involved in the control of cell cycle, especially in the regulation of checkpoints, DNA repair, senescence, and apoptosis thereby maintaining the genomic stability. C-Ha-Ras, a small G-protein belonging to the RAS superfamily of genes, plays a key role in mitogens-dependent signalling. Mutations in c-Ha-Ras lead to its constitutive activation resulting in activation of downstream signalling cascades (e.g. MAP kinase pathway, PI3K pathway). The increased signal transduction provides an unregulated mechanism of proliferative stimulation and self-sufficiency in growth signals. First, it was evidenced in my diploma thesis that OLO II, the newly developed CDK inhibitor had a strong anti-proliferative and pro-apoptotic potential that was comparable with or even exceeded that of ROSC. Secondly, it was shown that the effectivity of the used pharmacological CDK inhibitors on tested cancer cell lines markedly depended on the intrinsic status of p53 and c-Ha-Ras. Unlike OLO, ROSC and OLO II have been shown to strongly inhibit proliferation of two investigated human cancer cell lines (HL-60 and HeLa cells) and of two immortalized rat cell clones (402/534, 602/534). In apoptosis prone human HL-60 promyelocytic leukaemia cells the TP53 gene is disrupted. However, their checkpoint at the G1/S border is intact. HeLa cervical cancer cells are HPV-18 positive and, as a consequence of the expression of the HPV-encoded oncoproteins E6 and E7, p53 protein as well as the G1/S checkpoint are inactivated, respectively. The anti-proliferative effect was dosage- and time-dependent. Both inhibitors at lower dose generally arrest cell cycle progression and at higher concentration eliminate cells by apoptosis. Inhibition of cellular CDKs by ROSC or OLO II resulted in accumulation of the ratio of S- and/or G2- phase cells in all tested cell lines implicating that the type of cell cycle arrest induced in asynchronously growing cells by CDK inhibitors does not depend on the functional status of the G1/S checkpoint. Moreover, ROSC and OLO II induce the mitochondrial pathway of caspase-dependent apoptosis. Furthermore, the reduced susceptibility of transformed rat cells (189/111, 173/1022) to the CDK inhibitors indicates that overexpression of mutated c-Ha-Ras renders cancer cells insensitive or even resistant to the therapy. Finally, the status of p53 seems to be important for the outcome of the therapy by CDK inhibitors. ROSC is able to induce and even to reactivate p53 in HPV-positive cells. The up-regulated and activated p53 protein additionally promotes the growth-inhibitory and pro-apoptotic activities in treated cells.

Schlagwörter in Englisch

p53 / c-Ha-Ras / cell cycle regulation / CDK inhibitors

Abstract in German

Zellzyklusprogression wird durch die sequentielle und exakt koordinierte Aktivierung von Cyclin abhängigen Kinasen (CDKs), deren zugehörigen Cyclinen, von zellulären Inhibitoren der CDKs sowie vom Tumorsuppressorprotein p53 reguliert. Während der malignen Transformation kommt es zur Fehlregulierung von Zellzykluskomponenten und zur Inaktivierung von intrinsischen Inhibitoren von CDKs. Der oft beobachtete Verlust der zellulären CDK Inhibitoren in Krebszellen hat einige Forscher auf die Idee gebracht diese mit pharmakologischen Inhibitoren zu ersetzen. Dies führte zur Entwicklung von spezifischen CDK Inhibitoren, die in der Krebstherapie zunehmend eingesetzt werden. In meiner Diplomarbeit wurden drei miteinander verwandte dreifach substituierte Purine namens Olomoucine (OLO), Roscovitine (ROSC) und Olomoucine II (OLO II) für die Behandlung von Tumorzellen verwendet. Die Wirkungen der ersten beiden CDK Inhibitoren auf Krebszellen wurden bereits in mehreren experimentellen Modellen sowie auch in klinischen Studien gezeigt. Das Potential des erst kürzlich synthetisierten OLO II hingegen ist weitgehend unbekannt. Ein Vorteil von diesen drei dreifach substituierten Purine, der sie von konventionellen Cytostatikern unterscheidet, ist, dass sie nicht genotoxisch bzw.nur geringe cytotoxisch sind. Im Zuge dieser Diplomarbeit wurden die Effekte der oben angeführten CDK Inhibitoren auf zwei aggressive humane Krebszellen (HL-60 promyelozytische Leukemie und HeLa Gebärmutterhalskrebszellen) sowie auf die normalen humanen Fibroblasten (MRC-5 Zellen) evaluiert. Weiters verwendeten wir experimentelle Modelle, die es ermöglichten die Rolle der Gene TP53 und RAS, welche häufig in bösartigen Tumoren verändert sind zu studieren. Dafür wurden Zellklone, die temperatur sensitives (ts) p53135Val allein, oder in Kombination mit mutiertem c-Ha-Ras expremieren, verwendet. Diese Zellklone mit temperatur-sensitivem p53 ermöglichten es uns die Auswirkungen vom p53 Funktionsstatus (wild typ versus mutant) auf die Effizient von Anti-Krebstherapien in Zellen von gleichem genetischen Hintergrund zu studieren. Weiters erlaubte der Vergleich von Behandlungsergebnissen von immortalisierten Zellen (Überexpression von p53135Val) mit denen von transformierten Zellen (Überexpression von p53135Val + c-Ha-Ras) die Ermittlung des Einflusses von konstant expremierten pro-survival Genen wie z.B. RAS auf die Effizient von Krebstherapien. TP53 und RAS, zwei Gene die häufig während der malignen Transformation mutiert werden scheinen ausschlaggebend für die Sensitivität von Krebszellen für Therapie zu sein und stellen daher wichtige Ziele in der modernen Krebsforschung dar. TP53, welches für das Tumorsupressorprotein p53 kodiert, wird aufgrund der vielfältigen Aufgaben des Proteins in der Zelle auch “Wächter des Genoms” (Lane, 1992) genannt. Das p53 Protein ist in der Zellzyklusregulation - speziell bei der Regulation von Checkpoints - involviert und bekleidet weiters Funktionen in DNA Reperatur, Senescence und Apoptose. Auf diese Weise, erhält das Protein die genomische Stabilität. C-Ha-Ras, ein kleines G-Protein welches zur Familie der RAS superfamilie gehört spielt eine tragende Rolle in nährstoffabhängigen Signalwegen. Mutationen, die zur konstitutiven Aktivierung von c-Ha-Ras und somit seiner downstream Signalwege (z.B. MAP Kinase Signallweg, PI3K Signalweg) führen, ermöglichen unkontrollierte Proliferation und von wachstumsfaktoren-unabhängiges Wachstum. Während meiner Diplomarbeit konnten wir feststellen, dass OLO II, der kürzlich entwickelte CDK Inhibitor, genauso starke oder vielleicht sogar stärkere anti-proliverative und pro-apoptotische Wirkungen zeigt wie ROSC. Weiters konnten wir nachweisen, dass die Effektivität der getesteten pharmkologischen CDK Inhibitoren tatsächlich stark vom intrisischen p53 und c-Ha-Ras Status abhängt. Im Gegensatz zu OLO können OLO II und ROSC die Proliferation der humanen Krebszelllinien HL-60 und HeLa sowie die der beiden immortalizierten Rattenzelllinien (402/534, 602/534) hemmen. In den zur Apoptose neigenden humanen Leukämiezellen HL-60 ist TP53 inaktiviert. Trotzdem ist der G1/S checkpoint in dieser Zelllinie intakt. Im Gegensatz dazu, ist p53 und der G1/S Checkpoint in den HPV-18 positiven HeLa Gebärmutterhalskrebszellen aufgrund von den HPV-18 kodierten Oncoproteinen E6 und E7 inaktiv. In beiden Zelllinien konnten wir nachweisen, dass die anti-proliferative Wirkung zeit- und konzentrationsabhängig ist. In Folge von niedrigen OLO II oder ROSC Konzentrationen wurde Zellzyklusarrest induziert, höheren Konzentrationen hingegen führten zur Elimination der Zellen mittels Apoptose. Die Hemmung der zellulären CDKs durch ROSC oder OLO II führte zur Vermehrung der Zellpopulationen in der S- oder G2- Zellzyklusphase in allen verwendeten Zelllinien. Dies deutet darauf hin, dass die Art des Zellzyklusarrests - welcher in asynchron wachsenden Zellen durch CDK Inhibitoren induziert wird - nicht vom Funktionsstatus des G1/S checkpoint abhängig ist. Weiters induzieren ROSC und OLO II den mitochondrialen Signalweg der Apoptose. Das verminderte Therapieansprechen von den transformierten Ratenzellen (189/111, 173/1022) lässt vermuten, dass die Überexpression von mutiertem c-Ha-Ras dazu in der Lage ist, Krebszellen insensitiv oder sogar resistent gegenüber CDK Inhibitoren zu machen. Der p53 Status scheint wichtig für das Therapieergebnis mit CDK Inhibitoren zu sein. ROSC ist dazu in der Lage p53 in HPV-positiven Zellen zu reaktivieren. Dieses Protein führt in Folge zu Wachstumshemmung und pro-apoptotischen Effekten in behandelten Zellen.

Schlagwörter in Deutsch

p53 / c-Ha-Ras / Zellzyklusregulation / CDK Inhibitoren

Item Type: Hochschulschrift (Diplomarbeit)
Author: Walzi, Eva
Title: Comparison of the pro-apoptotic and anti-proliferative effects of two related CDK inhibitors
Umfangsangabe: 115 S., 16 Bl.
Institution: University of Vienna
Faculty: Fakultät für Lebenswissenschaften
Publication year: 2009
Language: eng ... Englisch
Supervisor: Heberle-Bors, Erwin
Assessor: Heberle-Bors, Erwin
Classification: 30 Naturwissenschaften allgemein > 30.03 Methoden und Techniken in den Naturwissenschaften
42 Biologie > 42.15 Zellbiologie
44 Medizin > 44.81 Onkologie
AC Number: AC08023988
Item ID: 4193
(Das PDF-Layout ist ident mit der Druckausgabe der Hochschulschrift.)

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