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Mode of action studies on (pre)clinically developed anticancer ruthenium compounds and thiosemicarbazones

Flocke, Lea Sophia Elise (2015) Mode of action studies on (pre)clinically developed anticancer ruthenium compounds and thiosemicarbazones.
Dissertation, Universität Wien. Fakultät für Chemie
BetreuerIn: Keppler, Bernhard
Gesperrt bis: 22 Februar 2018
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URN: urn:nbn:at:at-ubw:1-30070.40562.559461-4
URN: urn:nbn:at:at-ubw:1-30070.40562.559461-4

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Abstract in Englisch

New aspects of the molecular modes of action of different anticancer active metal complexes (based on ruthenium) and metal chelators (thiosemicarbazones) were investigated in this dissertation. The two well-investigated thiosemicarbazones, namely triapine and dimethylated triapine, had already been known known to inhibit ribonucleotide reductase (RNR). Triapine entered many clinical trials. We could show that dimethylation enhanced cytotoxic properties of triapine and both compounds were co-localizing with the endoplasmic reticulum (ER). Further analysis of the unfolded protein response (UPR), which is a response mechanism to ER stress, showed upregulation of several key factors on the protein as well as the mRNA level, which again was even higher when cells were treated with the dimethylated derivative. Apoptosis induction could also be shown. Inhibition of ER stress caused a significant decrease in cytotoxicity which supports the role of UPR in the mode of action of these thiosemicarbazones. Another part of this work is dedicated to the molecular mode of action of the clinically developed ruthenium based anticancer drug NKP-1339. Ruthenium is currently the most promising metal for anticancer treatment in clinical development. In particular, the complex sodium trans-[tetrachloridobis(1H-indazole)ruthenate(III)] is being clinically developed and showed promising results in many solid tumors, most distinctively in gastrointestinal neuroendocrine tumors. NKP-1339 binds different serum proteins very fast, mediating an increased uptake into the tumor tissue and when this Ru(III) complex enters the cell it is supposed to be activated by reduction. Here, it could be shown, that the effects of this compound in cell culture are inversely serum dependent. NKP-1339 cellular accumulation is reduced when serum concentration is increased which could be shown by ICP-MS measurements. Correspondingly, the cytotoxicity of NKP-1339 is decreased and the generation of reactive oxygen species (ROS) is reduced when serum concentration is increased. Nrf2 translocation induced by NKP-1339 treatment could be monitored by immunofluorescence microscopy. It is known that this transcription factor leads to antioxidant response by binding genes with antioxidant response elements (AREs) in their promotor region. Furthermore, it could be shown by Western blotting that the transmembrane receptor PERK is upregulated but vanishes after treatment with very high concentrations of NKP-1339. Its target protein eIF2α gets hyperphosphorylated and thereby activated upon NKP-1339 treatment. Its activation leads to translational inhibition of CAP dependent genes. The major ER resident chaperone GRP78 on the other hand is downregulated on the protein level, which leads to cell death as the cell can not adapt to the ER stress anymore. Moreover, it could be shown that CHOP is upregulated on the protein level, which is known to be a proapoptotic factor of the unfolded protein response (UPR). The mRNA levels of UPR genes were only mildly disturbed. The downregulation of GRP78 only on the protein level but not on the mRNA level suggests an involvement of ER associated protein degradation (ERAD). Finally the importance of ER stress for the mode of action of NKP-1339 could be shown by MTT tests where inhibition of ER stress by cycloheximide (CHX) or a JNK inhibitor leads to a decreased cytotoxicity of the ruthenium complex. The third part of this work focuses on novel 2-aryl-4-thiopyrone-based organometallics with ruthenium or osmium as the metal center. Ruthenium in these complexes shows an oxidation state of +II and therefore does not require activation at the tumor site. Cytotoxicities were shown in the low micromolar range, and hence preliminary mode-of--action studies were conducted. As topoisomerase IIα inhibiting capacity had been found in structurally closely related compounds, the effects on topoisomerase IIα were investigated. Only the complexes (and a rhodium based dimer) but not the metal-free ligands were able to inhibit the enzyme. The ability to induce ROS was investigated and could be excluded.

Schlagwörter in Englisch

Cancer therapy / inorganic chemistry / molecular biology / ruthenium / thiosemicarbazones / ER stress / UPR

Abstract in Deutsch

In dieser Dissertation wurden neue Aspekte der molekularen Wirkmechanismen verschiedener Metallkomplexe auf der Basis von Ruthenium und Metallchelatoren (Thiosemicarbazone), welche gegen Krebs(zellen) wirksam sind, untersucht. In diversen Studien wurde gezeigt, dass das gründlich untersuchte Thiosemicarbazon Triapin (3-AP) die Ribonukleotidreduktase inhibiert. Triapin wurde schon verschiedenen klinischen Studien geprüft. Wir konnten zeigen, dass die Dimethylierung von Triapin dessen Zytotxizität erhöht und sich beide Substanzen im endoplasmatischen Retikulum (ER) anhäufen. Die darauf basierende Untersuchung der unfolded protein response (UPR), welche eine molekulare Folge auf ER Stress ist, zeigte dass Schlüsselfaktoren sowohl auf Protein- als auch auf mRNA-Ebene hochreguliert sind. Diese Hochregulierung war wiederum stärker in Zellen, welche mit dem dimethylierten Derivat behandelt wurden. Darüber hinaus konnte die Induktion von Apoptose nachgewiesen werden. Die Hemmung des ER-Stresses führte zu einer signifikanten Reduktion der Zytotoxizität beider Substanzen, was die Rolle der UPR im Wirkmechanismus dieser Thiosemicarbazone unterstützt. Ein weiterer Teil der Arbeit ist dem molekularen Wirkmechanismus des klinisch entwickelten, auf Ruthenium basierenden, krebshemmenden Wirkstoffs NKP-1339 gewidmet. Ruthenium ist momentan das aussichtsreichste Metall in der Entwicklung für die Krebstherapie. Insbesondere Natrium trans-[tetrachloridobis(1H-indazol)ruthenat(III)] befindet sich in der klinischen Entwicklung und zeigt vielversprechende Ergebnisse in verschiedenen soliden Tumoren, vor allem die Aktivität in gastrointestinalen neuroendokrinen Tumoren. NKP-1339 bindet schnell und mit mittlerer Affinität an verschiedene Serumproteine, wodurch eine erhöhte Anreicherung im Tumorgewebe erreicht werden kann. Nach der Aufnahme des Ru(III)-Komplexes in die Zelle wird dieser vermutlich durch Reduktion aktiviert. Es konnte hier gezeigt werden, dass die Aktivität eine starke Serum-Abhängigkeit aufweist. Die zelluläre Akkumulation ist bei Behandlung unter erhöhter Serum-Konzentration verringert, was durch ICP-MS-Messungen gezeigt werden konnte. Darüber hinaus sind die Zytotoxizität und die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies verringert, wenn der Serumgehalt erhöht wird. Ferner konnte die Nrf2-Translokation (und somit Aktivierung) durch Immunofluoreszenzmikroskopie gezeigt werden. Es ist bekannt, dass diese Translokation zur Aktivierung von Genen führt, welche ein ARE in ihrem Promotor haben, und eine antioxidative Antwort hervorruft. Durch Western Blot-Experimente konnte gezeigt werden, dass PERK hochreguliert wird und dessen Zielprotein eIF2α verstärkt phosphoryliert und somit aktiviert wird. Die Aktivierung von PeIF2α führt zur Hemmung der Translation CAP-abhängiger Gene. Außerdem konnte gezeigt werden, dass eines der Hauptchaperone des ERs – GRP78 – degradiert wird. Dies führt zum Zelltod, da die Zelle nicht mehr angemessen auf den ER-Stress reagieren kann. Des weiteren wird das Protein CHOP hochreguliert. CHOP ist ein proapoptotischer Faktor der unfolded protein response. Auf mRNA-Ebene konnten nur geringe Störungen festgestellt werden, was die Beteiligung von ER-assoziierter Proteindegradierung (ERAD) nahelegt. Zuletzt konnte die Wichtigkeit des ER-Stress für den Wirkmechanismus, durch MTT-Experimente nachgewiesen werden. Inhibierung von ER-Stress durch zwei verschiedene Inhibitoren – Cycloheximid (CHX) und einem JNK-Inhibitor – verringert die zytotoxische Wirkung des Rutheniumkomplexes. Der dritte Teil der Arbeit befasst sich mit neuen 2-aryl-4-thiopyrone-basierten organometallischen Substanzen. Die Rutheniumkomplexe weisen eine Oxidationsstufe von II auf und müssen somit nicht mehr im Tumor aktiviert werden. Da Zytotoxizitäten im niedrigen mikromolaren Konzentrationsbereich gezeigt werden konnten, wurden vorläufige Studien den Wirkmechansimus betreffend durchgeführt. Da bei strukturell eng verwandten Substanzen topoisomerase IIα-inhibierende Eigenschaften festgestellt wurde, wurden die Effekte auf dieses Enzym untersucht. Diese Studien ergaben, dass nur die Komplexe und nicht die Liganden alleine zu einer Inhibierung des Enzyms führen können, allerdings konnte auch ein Rhodiumdimer die Enzymaktivität beeinträchtigen. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass keine reaktiven Sauerstoffspezies induziert werden.

Schlagwörter in Deutsch

Krebstherapie / Anorganische Chemie / Molekularbiologie / Ruthenium / Thiosemicarbazones / ER Stress / UPR

Dokumentenart: Hochschulschrift (Dissertation)
AutorIn: Flocke, Lea Sophia Elise
Titel: Mode of action studies on (pre)clinically developed anticancer ruthenium compounds and thiosemicarbazones
Umfangsangabe: 95 Seiten : Illustrationen, Diagramme
Institution: Universität Wien
Fakultät: Fakultät für Chemie
Studiumsbezeichnung bzw.
Universitätslehrgang (ULG):
Doktoratsstudium NAWI aus dem Bereich Naturwissenschaften (Dissertationsgebiet: Chemie)
Publikationsjahr: 2015
Sprache: eng ... Englisch
BetreuerIn: Keppler, Bernhard
BeurteilerIn: Somoza, Veronika
2. BeurteilerIn: Marian, Brigitte
Klassifikation: 35 Chemie > 35.79 Biochemie: Sonstiges
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie
30 Naturwissenschaften allgemein > 30.00 Naturwissenschaften allgemein: Allgemeines
AC-Nummer: AC13043366
Dokumenten-ID: 41096
(Das PDF-Layout ist ident mit der Druckausgabe der Hochschulschrift.)

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