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Detection and characterization of PAX5 aberrations in childhood acute lymphoblastic leukemia

Nebral, Karin (2008) Detection and characterization of PAX5 aberrations in childhood acute lymphoblastic leukemia.
Dissertation, University of Vienna. Fakultät für Lebenswissenschaften
BetreuerIn: Haas, Oskar

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DOI: 10.25365/thesis.3729
URN: urn:nbn:at:at-ubw:1-29731.06579.824960-4

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Abstract in English

PAX5, a master regulator of B-cell development, was recently shown to be involved in several B-cell malignancy-associated genetic alterations, such as point mutations, deletions, and, of particular interest in the context of my work, also gene rearrangements. In B-cell non-Hodgkin's-Lymphoma with a t(9;14)(p13;q32), for instance, PAX5 is juxtaposed to the IGH@ locus, which results in an inappropriate over-expression of PAX5. In B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia (BCP-ALL), on the other hand, PAX5 can fuse to several different partner genes such as FOXP1 (3p13), AUTS2 (7q11), ELN (7q11), ETV6 (12p13), ZNF521 (18q11), and C20orf112 (20q11), thereby generating fusion transcripts that encode chimeric proteins. Therefore, the aim of this study was to screen childhood ALL samples for PAX5 rearrangements and to determine their incidence and the types of PAX5 gene fusions in a systematic and population-based fashion. To identify all potential PAX5-affecting breakpoints, including even those that result in juxtaposition of PAX5 under the regulatory elements of a partner gene, a novel dual-color split-apart fluorescence in situ hybridization (FISH) assay with BAC clones flanking the PAX5 gene was employed. All samples with suspicious FISH patterns were further analyzed with PAX5 exon-specific cosmid clones. In order to facilitate high-throughput screening, interphase FISH analysis was performed using an automated spot counting system (Metafer4-Metacyte, Metasystems). Novel fusion partners were identified by FISH, 3'- or 5'-RACE (Rapid Amplification of cDNA ends) and the presence of specific hybrid transcripts was verified by RT-PCR (Reverse Transcription-PCR) and sequence analysis. A PAX5 rearrangement-indicating FISH pattern was observed in 10 (2.2%) of 446 children with de novo ALL registered in the Austrian ALL-BFM 2000 and Interfant-99 studies. Out of these 10 patients, one case was previously shown to harbor a PAX5-ETV6 fusion, in one the recently described PAX5-C20orf112 gene fusion was found and, despite all efforts, the fusion partner remained unidentified in another one. However, in seven cases we succeeded to identify six new PAX5 in-frame fusions with HIPK1 (1p13), POM121 (7q11), JAK2 (9p24), DACH1 (13q21), PML (15q24), or BRD1 (22q13.33). Apart from two PAX5-JAK2-positive cases, every other fusion gene was non-recurring. Moreover, at least in childhood ALL we did not find any evidence for PAX5 activating translocations. Given the large variety of recovered PAX5 fusion partners, our custom-made dual-color/two-step FISH screening approach has proven to be an appropriate and efficient tool for the reliable detection of PAX5 gene fusions. The results of this study show that PAX5 rearrangements occur with a frequency of approximately 2.5% exclusively in BCP-ALL and fuse PAX5 to a broad range of different partner genes comprising transcription factors, structural proteins, and even a tyrosine kinase. All hypothetical fusion proteins retain at least the PAX5 paired DNA-binding domain, which is joined to the C-terminal region or even the entire protein of the fusion partner. Thus, all PAX5 chimeric proteins are predicted to retain the ability to bind to PAX5 target genes suggesting that they act as aberrant transcription factors, which may antagonize intrinsic PAX5 transcriptional activity, and hence, may contribute to the pathogenesis of BCP-ALL.

Schlagwörter in Englisch

PAX5 / PAX5 rearrangements / fusion genes / FISH screening / childhood acute lymphoblastic leukemia

Abstract in German

PAX5 ist ein Transkriptionsfaktor der Paired Box Genfamilie, welcher sowohl für die Entwicklung von B-Zellen aus hämatopoietischen Vorläuferzellen als auch für deren Fortbestand als reife B-Zellen von essentieller Bedeutung ist. Vor kurzem wurde gezeigt, dass PAX5 in B-Zell-Neoplasien häufig involviert ist. Die entsprechenden genetischen Alterationen umfassen Punktmutationen und Deletionen und, von besonderem Interesse im Zusammenhang mit meiner Arbeit, auch Genrearrangements. In B-Zell-Non-Hodgkin-Lymphomen mit einer t(9;14)(p13;q32), zum Beispiel, gelangt das PAX5 Gen durch die Translokation in die Nähe des IGH@ Locus, wodurch es zu einer Überexpression von PAX5 kommt. Im Gegensatz dazu wurden bei akuten lymphatischen B Vorläuferzell Leukämien ("B-cell-precursor"; BCP-ALL) Fusionen des PAX5 Gens mit FOXP1 (3p13), AUTS2 (7q11), ELN (7q11), ETV6 (12p13), ZNF521 (18q11) und C20orf112 (20q11) beschrieben, wobei die daraus resultierenden Fusionstranskripte für chimäre Proteine kodieren. Das Ziel der vorliegenden Studie war es daher, die Häufigkeit und Art von PAX5 Genrearrangements bei ALL im Kindesalter systematisch zu untersuchen, sowie neue PAX5 Fusionspartner zu identifizieren und zu charakterisieren. Die 446 analysierten Proben stammen von konsekutiv in den österreichischen ALL-BFM 2000 und Interfant-99 Studien registrierten PatientInnen und repräsentieren daher eine unselektierte und klinisch gut charakterisierte Kohorte. Zum Nachweis von potentiellen PAX5 Genrearrangements wurden eigene Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) Assays entwickelt und die Interphase FISH Muster mithilfe der Metafer4-Metacyte Software (Metasystems) automatisch ausgewertet. Um alle im PAX5 Gen möglichen Bruchpunkte zu erfassen (auch jene, die zu einer veränderten Expression des intakten PAX5 Gens durch ein Partnergen führen) wurden primär das Gen flankierende zwei Farben FISH Sonden verwendet. Auffällige FISH Muster wurden weiter mit Gen-spezifischen Sonden abgeklärt. Anschließend wurden die Fusionspartner entweder mit FISH und/oder 3'- oder 5'-RACE (Rapid Amplification of cDNA ends) identifiziert und das Vorhandensein der chimären Transkripte mittels RT-PCR (Reverse Transcription-PCR) und Sequenzierung überprüft. 10 von 446 untersuchten Proben (2.2%) zeigten ein für ein PAX5 Rearrangement charakteristisches FISH Muster. Ein Fall mit einer PAX5-ETV6 Fusion war bereits aus Vorbefunden bekannt, bei einem weiteren wurde eine kürzlich in der Literatur beschriebene PAX5-C20orf112 Genfusion gefunden und bei einem Patienten konnte die vorliegende PAX5 Aberration trotz intensiver Analysen nicht vollständig aufgeklärt werden. Jedoch gelang es uns bei sieben Fällen sechs neue PAX5 Fusionspartner zu identifizieren: HIPK1 (1p13), POM121 (7q11), JAK2 (9p24), DACH1 (13q21), PML (15q24) und BRD1 (22q13.33). Mit Ausnahme von zwei PAX5-JAK2 positiven Fällen, traten alle anderen Fusionen jeweils nur einmal auf. Weiters konnten, zumindest bei der ALL im Kindesalter, keine PAX5-aktivierenden Translokationen gefunden werden. Aufgrund der großen Heterogenität der Fusionspartner ist die von uns etablierte FISH Strategie eine verlässliche und sinnvolle Screeningmethode mit der alle potentiellen PAX5 Genfusionen systematisch erfasst werden können. Aus dem Ergebnis meiner Studie kann man zusammenfassend ableiten, dass zirka 2.5% der BCP-ALL Fälle PAX5 Genfusionen aufweisen, welche jedoch eine Vielzahl von Partnergenen betreffen, die nicht nur Transkriptionsfaktoren sondern auch Strukturproteine und eine Tyrosinkinase, einschließen. Die hypothetischen Fusionsproteine bestehen in allen Fällen zumindest aus der PAX5-paired DNA-Bindungsdomäne, die mit der C-terminalen Region oder sogar dem gesamten Protein des jeweiligen Partners fusioniert. Die Struktur der PAX5 chimären Proteine legt nahe, dass diese zwar an PAX5 Zielgene binden können, aber keine normale transkriptionelle Regulation ausüben und dadurch der intrinsischen PAX5-Aktivität entgegenwirken, was möglicherweise bei der Pathogenese der BCP-ALL eine Rolle spielt.

Schlagwörter in Deutsch

PAX5 / PAX5 Rearrangements / Genfusionen / FISH Screening / akute lymphatische Leukämien im Kindesalter

Item Type: Hochschulschrift (Dissertation)
Author: Nebral, Karin
Title: Detection and characterization of PAX5 aberrations in childhood acute lymphoblastic leukemia
Umfangsangabe: 129 S. : Ill., graph. Darst.
Institution: University of Vienna
Faculty: Fakultät für Lebenswissenschaften
Publication year: 2008
Language: eng ... Englisch
Supervisor: Haas, Oskar
Assessor: Marschalek, Rolf
2. Assessor: Jantsch, Michael
Classification: 42 Biologie > 42.20 Genetik
AC Number: AC05039208
Item ID: 3729
(Das PDF-Layout ist ident mit der Druckausgabe der Hochschulschrift.)

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