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Different phenotypes of CAv1.4 loss-of-function mutations

Pöhn, Birgit (2014) Different phenotypes of CAv1.4 loss-of-function mutations.
Masterarbeit, University of Vienna. Zentrum für Molekulare Biologie
BetreuerIn: Koschak, Alexandra

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DOI: 10.25365/thesis.33122
URN: urn:nbn:at:at-ubw:1-29469.53541.947470-5

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Abstract in English

The L-type calcium channel Cav1.4 is almost exclusively expressed in the retina, where it couples changes in illumination to glutamate release. Different dysfunction phenotypes of this channel have been shown to cause congenital stationary night blindness type 2 (CSNB2). In this study, I analysed three prototypical Cav1.4 mutations that were found in CSNB2 patients. I expressed these channels in tsA-201 cells and investigated their biophysical properties by whole-cell patch clamp technique. The point mutation L216R (LR), which is located in the voltage sensor showed a loss-of-function phenotype, as no calcium influx could be detected. This could be either explained by a reduced number of channels on the cell membrane or by non-functional LR channels at the membrane. We observed gating currents in a minority of cells, indicating cell surface expression. In addition, we found a tendency towards increased protein degradation. Taken together, this phenotype is likely to be caused by a functional uncoupling of the voltage sensor movement and pore opening. The truncation mutant R1827X (RX) lacks the C-terminal modulator domain that is responsible for the suppression of calcium-dependent inactivation (CDI). Thus, this channel exhibited CDI, compatible with a loss of function. In addition, the activation was shifted leftwards by -10 mV, indicating a gain of function. This complex phenotype could be rescued by coexpression of a C-terminal peptide comprised of 122 amino acids. Previous studies suggested that a shorter peptide should be sufficient to restore wild type properties. However, we did not observe any change in RX gating properties upon coexpression with this short eGFP-tagged peptide. We speculate that this may be due to steric hindrance of the big tag and further studies are necessary to resolve this issue. The I745T (IT) mutation was found in a New Zealand family and causes a particularly severe form of CSNB2, as symptoms can also be found in heterozygous females and some hemizygous males show additional intellectual impairment. Functionally, the IT channels exhibited a dramatic leftward shift (-34 mV) in activation that results in a gain of function phenotype. Taken together, these different mutations reflect the variety of Cav1.4 dysfunction phenotypes found in CSNB2 patients. As a consequence, these fundamental differences in the underlying functional defect have to be taken into account for future therapeutic approaches aiming to restore Cav1.4 wild type properties.

Schlagwörter in Englisch

calcium channel / retina / electrophysiology / Cav1.4

Abstract in German

Der L-Typ Kalziumkanal Cav1.4 wird beinahe ausschließlich in der Retina exprimiert, wo er Helligkeitsänderungen mit Glutamatfreisetzung koppelt. Um dieser Aufgabe gerecht zu werden, muss der Kanal lang anhaltenden Kalziumeinstrom vermitteln, was durch das Fehlen kalziumabhängiger Inaktivierung erreicht wird. Es sind verschiedene Mutationen in Cav1.4 bekannt, die eine kongenitale Form stationärer Nachtblindheit (CSNB2) verursachen. Es ist nicht bekannt, wie diese funktional sehr unterschiedlichen Mutationen die gleiche Krankheit hervorrufen können. In dieser Studie habe ich drei prototypische Mutationen untersucht, die in CSNB2 Patienten identifiziert wurden. Dazu habe ich diese Kanäle heterolog in tsA-201 Zellen exprimiert und ihre biophysikalischen Eigenschaften in elektrophysiologischen Experimenten ermittelt, um zu erforschen, wie diese Mutationen die Eigenschaften des Kanals verändern. Die L216R (LR) Mutation, die im Spannungssensor des Kanals lokalisiert ist, verursachte einen „loss-of-function“ Phänotyp, da kein Kalziumeinstrom durch den Kanal detektiert werden konnte. Dies kann einerseits durch eine reduzierte Anzahl von Kanälen an der Zellmembran, andererseits durch nicht funktionale Kanäle erklärt werden. Wir konnten in einigen Zellen „gating current“ detektieren, was darauf hindeutet, dass Kanäle auf der Zelloberfläche vorhanden sind. Zusätzlich fanden wir eine Tendenz zu einem schnelleren Abbau von LR Kanälen. Zusammenfassend wird dieser Phänotyp wahrscheinlich durch funktionelle Entkopplung des Spannungssensors vom Öffnen der Pore verursacht, was zu einem Funktionsverlust von Cav1.4 führt. Die R1827X (RX) Mutation führt dazu, dass die C-terminale Domäne fehlt, welche kalziumabhängige Inaktivierung in Cav1.4 unterdrückt. Daher zeigte dieser Kanal kalziumabhängige Inaktivierung, was einem „loss-of-function“ Phänotyp entspricht. Zusätzlich war die Aktivierung um -10mV nach links verschoben, was wiederum einem „gain-of-function“ Phänotyp gleichkommt. Wurde ein 122 Aminosäuren langes C-terminales Peptid koexprimiert, konnten die biophysikalischen Eigenschaften des Wildtyp-Kanals wiederhergestellt werden. Frühere Studien haben darauf hingedeutet, dass ein kürzeres Peptid ausreichen sollte, um diesen „rescue“ zu erreichen. Allerdings wurden die Eigenschaften des RX Kanals durch Koexpression dieses kürzeren eGFP-getaggten Peptids nicht verändert. Dies ist möglicherweise darauf zurückzuführe, dass dieser große eGFP-Tag die korrekte Interaktion des Peptides mit dem Kanal verhindert und weitere Untersuchungen sind vonnöten, um diese Frage zu beantworten. Die I745T (IT) Mutation wurde in einer neuseeländischen Familie identifiziert und verursacht eine besonders schwere Form von CSNB2. In dieser Familie zeigen auch heterozygote Frauen Symptome und einige hemizygote Männer leiden zusätzlich unter kognitiven Beeinträchtigungen. Was die Funktion des IT Kanals betrifft, so zeigte sich ein dramatischer Linksshift (-34mV) der spannungsabhängigen Aktivierung, was in einem „gain-of-function“ Phäntyp resultiert. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese drei Mutationen die große Vielfalt an Phänotypen, die durch Mutationen in Cav1.4 entstehen und zu CSNB2 führen, repräsentieren. Folglich sind die zugrundeliegenden funktionalen Defekte höchst unterschiedlich und diese Unterschiede müssen für zukünftige therapeutische Ansätze, die die Eigenschaften des Wildtyp-Kanals wieder herstellen sollen, berücksichtigt werden.

Schlagwörter in Deutsch

Kalziumkanal / Retina / Electrophysiologie / Cav1.4

Item Type: Hochschulschrift (Masterarbeit)
Author: Pöhn, Birgit
Title: Different phenotypes of CAv1.4 loss-of-function mutations
Umfangsangabe: 52 S. : graph. Darst.
Institution: University of Vienna
Faculty: Zentrum für Molekulare Biologie
Publication year: 2014
Language: eng ... Englisch
Supervisor: Koschak, Alexandra
Assessor: Koschak, Alexandra
Classification: 42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie
42 Biologie > 42.12 Biophysik
44 Medizin > 44.37 Physiologie
44 Medizin > 44.48 Medizinische Genetik
AC Number: AC12060692
Item ID: 33122
(Das PDF-Layout ist ident mit der Druckausgabe der Hochschulschrift.)

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