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Elemental labeling of antibody fragments for LC-ICP-MS based immunoassays

Mairinger, Teresa (2013) Elemental labeling of antibody fragments for LC-ICP-MS based immunoassays.
Masterarbeit, Universität Wien. Fakultät für Chemie
BetreuerIn: Krachler, Regina

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URN: urn:nbn:at:at-ubw:1-30322.00730.413263-6
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Abstract in Englisch

The derivatisation of antibodies with elemental labels and their ICP-MS based detection offers the possibility for indirect quantification of various targets (e.g. cancer markers or cellular metabolites). This straight-forward technique is applicable for e.g. immunoassays via ICP-MS based absolute quantification of the targets in biological samples. As the assessed samples are characterized by a complex matrix, limited sample volume and low concentrations of the analyte (e.g. a biomarker), quantification requires highly sensitive, selective and robust strategies. The aim of this master thesis was the development of a labeling procedure for a genetically modified antigen binding fragment (Fab), so-called ThioFab (Junutula JR et al. 2008), with rare earth element label macrocycles, and its analysis via liquid chromatography inductively coupled plasma mass spectrometry (LC-ICP-MS). For the first time a labeling procedure for a ThioFab with lanthanide label macrocycles was developed. The employment of this ThioFab, which carries an additional recombinantly introduced cysteine, allows a straight-forward labeling. Due to this introduced cysteine residue, only a mild reduction step, prior to the attachment of the elemental label lanthanide-DOTA-maleimid, was necessary and therefore no fragmentation was obtained. The optimization of the labeling procedure was performed in terms of coordination of selected lanthanides by the complexing moiety and the linking reaction of the complex to the ThioFab. Pre-optimization steps were performed with human serum albumin as model protein. By applying the optimized labeling procedure the labeling degree of the genetically modified ThioFab increased from 0.4% to 40%. As a proof of concept the formation of the final ThioFab/ antigen conjugate employing Anti-Her2/ Her2 as model system was successfully demonstrated.

Schlagwörter in Englisch

Labeling / Elemental labeling / antibody fragments / genetically modified antigen binding fragment / ThioFab / inductively coupled plasma mass spectrometry / absolute quantification / Immunoassay

Abstract in Deutsch

Die Derivatisierung von Antikörpern mit elementmarkierten Liganden und deren Detektion mittels hochempfindlicher induktiv gekoppeltes Plasma Massenspektrometrie bietet die Möglichkeit zur indirekte Quantifizierung unterschiedlicher Analyten in biologischen und biomedizinischen Fragestellungen (z.B.: Krebs-Biomarker oder zelluläre Metabolite). Diese Art der Detektion findet beispielsweise Anwendung bei Immunoassays mit absoluter Quantifizierung in biologischen Proben. Die zu analysierenden Proben zeichnen sich durch eine komplexe Matrix, ein begrenztes Probenvolumen und niedrige Konzentrationen des Analyten (z.B. ein Biomarker) aus. Daher ist die Entwicklung von hochempfindlichen, selektiven und robusten Quantifizierungsstrategien erforderlich. Ziel dieser Masterarbeit war die Entwicklung einer Markierungsmethode für ein gentechnisch verändertes Antigen bindendes Fragment (Fab), ein sogenannter ThioFab (Junutula JR et al. 2008), mit einem Elementlabel, bestehend aus dem Makrozyklus DOTA und einem Lanthanid als Chelation. Die Messung erfolgte über Flüssigkeitschromatographie kombiniert mit induktiv gekoppeltes Plasma-Massenspektrometrie (LC-ICP-MS). Zum ersten Mal wurde eine Markierungsmethode für einen ThioFab mit einem Elementlabel entwickelt. Der Einsatz dieses ThioFabs, welcher ein rekombinant eingeführtes Cystein trägt, ermöglicht ein einfaches Labelingprozedere. Durch diesen eingeführten Cysteinrest ist lediglich ein milder Reduktionsschritt vor der Umsetzung mit dem Elementlabel Lanthanoid-DOTA-Maleimid, notwendig. Dadurch kommt es zu keiner Fragmentierung des ThioFabs und daher zur Beibehaltung der hohen Selektivität des Fab. Die Optimierung der Markierungsmethode wurde einerseits im Hinblick auf die Koordinierung des ausgewählten Lanthanids durch den Komplexbildner DOTA und andererseits bezüglich der Reaktion des Komplexes mit dem ThioFab, durchgeführt. Vorversuche wurden mit humanem Serum Albumin als Modellprotein durchgeführt. Durch die Anwendung der optimierten Markierungsmethode wurde der Markierungsgrad des gentechnisch veränderten ThioFab von 0.4% auf 40% erhöht. Als Proof of Concept wurde die Bildung des ThioFab/ Antigen Konjugates mit Anti-Her2/ Her2 als Modellsystem erfolgreich gezeigt.

Schlagwörter in Deutsch

Markierung / Elementlabel / Antikörper Fragmente / genetisch verändertes Antigen bindendes Fragment / ThioFab / induktiv gekoppeltes Plasma Massenspektrometrie / absolute Quantifizierung / Immunoassay

Dokumentenart: Hochschulschrift (Masterarbeit)
AutorIn: Mairinger, Teresa
Titel: Elemental labeling of antibody fragments for LC-ICP-MS based immunoassays
Umfangsangabe: 65 S. : Ill., graph. Darst.
Institution: Universität Wien
Fakultät: Fakultät für Chemie
Publikationsjahr: 2013
Sprache: eng ... Englisch
BetreuerIn: Krachler, Regina
BeurteilerIn: Krachler, Regina
Klassifikation: 35 Chemie > 35.23 Analytische Chemie: Allgemeines
35 Chemie > 35.26 Massenspektrometrie
35 Chemie > 35.29 Chromatographische Analyse, Elektrophorese
35 Chemie > 35.43 Koordinationsverbindungen, Komplexchemie
AC-Nummer: AC11708732
Dokumenten-ID: 29703
(Das PDF-Layout ist ident mit der Druckausgabe der Hochschulschrift.)

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