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Non-viral transient gene therapy for bone regeneration

Feichtinger, Georg Alexander (2012) Non-viral transient gene therapy for bone regeneration.
Dissertation, University of Vienna. Zentrum für Molekulare Biologie
BetreuerIn: Redl, Heinz
Gesperrt bis: 13 February 2014

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URN: urn:nbn:at:at-ubw:1-29218.36053.756753-6

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Abstract in English

Critical size bone defects, caused by severe tissue trauma or resection surgery represent a challenging clinical problem in trauma surgery/orthopaedics. These defects can lead to non-union fractures, which fail to regenerate and are a substantial burden on patients and health-care systems worldwide. Alternative treatment strategies to conventional fracture management are bone grafting from autologous sources or the application of high doses of recombinant bone morphogenetic protein (BMP)growth factors. While grafting is associated with donor site morbidity, BMPs can lead to adverse effects by supraphysiologic dosing. Therefore, novel treatment modalities are required for the minimally invasive, cost-effective and safe treatment of bone defects, preferably omitting the use of stem cells, biomaterials and recombinant growth factors. Non-viral transient somatic gene therapy offers methods for the in situ manipulation of endogenous cells at the defect site for growth factor expression at relatively low cost and potential high performance, due to endogenous production and release of an active morphogen. It was the aim of this study to design and evaluate a non-viral in vivo gene therapy protocol for osteoinduction. A highly osteoinductive combination of bone morphogenetic protein 2 and 7 therapeutic genes was identified in in vitro experiments, supported by the use of a novel enhanced reporter gene assay for osteogenic differentiation. BMP2/7 was subsequently employed in the design of novel constitutive and inducible therapeutic co-expression plasmids. Multi-cassette based BMP2/7 co-expression from such constitutive or inducible plasmids was characterized and compared to recombinant growth factor induced osteogenic differentiation in vitro. After successful in vitro testing, the novel co-expression plasmids were tested for in vivo osteoinduction using passive gene delivery or active sonoporative gene transfer in ectopic and orthotopic in vivo rodent models. In vitro evaluation of constitutive multi-cassette BMP2/7 co-expression plasmids revealed impaired induction of osteogenic differentiation compared to combined delivery of individual BMP2 and 7 plasmids due to transcriptional interference occurring in the single-plasmid co-expression system. This transcriptional interference related impairment of co-expression associated bioactivity was related to relative transcription cassette orientation, causing stronger interference in tandem expression cassette orientation. Inducible co-expression of BMP2/7 from a single-vector TetON inducible expression plasmid, showed potent osteoinduction and tight control over transgene expression in vitro. In vivo gene delivery studies in ectopic and orthotopic models showed that sonoporation could enhance non-viral gene delivery compared to passive gene transfer, increasing the overall rate of successful gene delivery and osteoinduction up to 100%. Localized ectopic and orthotopic gene expression was confirmed by bioluminescence imaging and immunohistochemistry. BMP2/7 in vivo gene delivery by constitutive or inducible BMP2/7 co-expression systems demonstrated potent osteoinduction in vivo after repeated delivery with either passive or sonoporative gene transfer. In vivo gene delivery using the inducible system again demonstrated tight regulation of osteogenesis via the inductor doxycycline. Orthotopic testing (0% union rate) indicated an enhancing effect of non-viral BMP2/7 gene co-delivery in critical sized femur fracture models, leading to a union rate of 33% in the treatment group. We conclude from our in vitro and in vivo findings that BMP2/7 is a potent osteoinductive therapeutic gene combination, which can be delivered in constitutive or inducible multi-cassette co-expression plasmids for osteoinduction using passive or sonoporative gene transfer in vivo. Sonoporation has been shown to enhance overall gene transfer probability. Tight control of in vivo transgene expression has been demonstrated using inducible systems. Therefore, the novel treatment approach of sonoporative BMP2/7 co-expression in vivo can be considered a promising alternative to recombinant growth factor application in tissue regeneration and could provide a potential novel therapy for clinical translation after further improvement. This includes establishing higher gene transfer efficacy & reducing the number of repetitive treatments and a reduction of DNA dosing.

Schlagwörter in Englisch

Non-viral / transient / somatic / gene therapy / sonoporation / tissue engineering / Bone morphogenetic protein / heterodimer / osteoinduction / fracture healing / TetON / inducible, co-expression

Abstract in German

Knochendefekte kritischer Größe werden durch massives Trauma oder chirurgische Resektion verursacht und stellen ein signifikantes klinisches Problem dar. Diese Defekte können sich zu Pseudoarthrosen entwickeln und sind weltweit eine Belastung für Patienten und Gesundheitsysteme. Transplantation von autologem Knochen oder Verabreichung von hohen supraphysiologischen Mengen rekombinanter Wachstumsfaktoren sind derzeit die einzigen Behandlungsalternativen mit erheblichen Nebenwirkungen für den Patienten. Aus diesem Grund werden neue, minimal-invasive, kosteneffektive und sichere Behandlungsmethoden erforderlich, welche nicht auf der Verwendung von autologem Gewebe, autologen Stammzellen, Biomaterialien oder rekombinanten Wachstumsfaktoren aufbauen. In dieser Studie wurde nicht-virale transiente somatische Gentherapie, untersucht. die in situ Manipulation von endogenen Zellen zu Überexpression von Wachstumsfaktoren im Defekt ermöglicht. Dies kann zu relativ geringen Kosten und mit potentieller hoher therapeutischer Effizienz erfolgen, da im Defektareal eine kontinuierliche Freisetzung eines endogen produzierten hochaktiven Wachstumsfaktor erreicht wird . Eine hoch-bioaktive Genkombination von bone morphogenetic protein 2 und 7 (BMP2/7) wurde in in vitro Experimenten mit Unterstützung eines neu entwickelten Reportergen Systems identifiziert und anschließend für die Entwicklung von neuen konstitutiven und induzierbaren Co-Expressionsplasmiden eingesetzt. Die Co-Expression von BMP2/7 von diesen konstitutiven und induzierbaren Multi-Kassetten wurde in vitro auf ihr osteogenes Potenzial hin untersucht und mit rekombinanten Wachstumsfaktoren verglichen. Nach erfolgreichen in vitro Experimenten wurden diese Plasmide in ektopen und orthotopen in vivo Modellen mit passivem oder Ultraschall-basiertem Gentransfer (Sonoporation) in Nagetieren getestet. In vitro Experimente zeigten, dass die konstitutiven Multi-Kassetten BMP2/7 Co-Expressionsysteme ein reduziertes osteogenes Potenzial im Vergleich zur Co-Transfektion von BMP2 und BMP7 Plasmiden aufwiesen, welches auf transkriptionale Interferenz zurückgeführt werden kann. Diese transkriptionale Interferenz war von der Orientierung der Expressionskassetten abhängig und trat bei Tandem Orientierung der Expressionskassetten vermehrt auf. Induzierbare Co-Expression von BMP2/7 und osteogene Differenzierung in vitro mittels eines modifizierten TetON-induzierbaren Expressionsplasmides konnte gezielt über einen Induktor (Doxyzyklin) gesteuert werden. In vivo nicht-viraler Gentransfer in ektopen und orthotopen Modellen zeigte, dass Sonoporation die Wahrscheinlichkeit eines erfolgreichen Gentransfers im Vergleich zu passivem Gentransfer bis auf 100% steigern kann. Lokalisierte ektope und orthotope in vivo Genexpression konnte mit Biolumineszenz-Bildgebung und Immunfärbungen nachgewiesen werden. BMP2/7 in vivo Gentransfer mittels konstitutiver oder induzierbarer BMP2/7 Co-Expressionssystemen führte zu potenter Osteoinduktion nach wiederholtem Gentransfer. In vivo Verabreichung des induzierbaren Systems, ermöglichte spezifische Kontrolle der therapeutischen Genexpression über den Induktor Doxyzyklin. Orthotope Evaluierung der BMP2/7 Gentransfer-Strategie deutet auf eine verbesserte Knochenheilung (33% Heilung in der Therapiegruppe) in Femurdefekten kritischer Größe hin. Aus den in vitro und in vivo Ergebnissen schlussfolgernd, wird festgestellt, dass BMP2/7 Co-Expression eine potente osteoinduktive therpeutische Strategie ist, welche über konstitutive oder induzierbare Co-Expressionsplasmide mit passivem oder aktivem Gentransfer verabreicht werden kann. Sonoporation führt zu einer Zunahme der Frequenz erfolgreichen Gentransfers und genaue Kontrolle der Transgen Co-Expression kann durch induzierbare Systeme in vivo gewährleistet werden. Aufrgrund der Ergebnisse kann die Behandlungsstrategie der BMP2/7 in vivo Sonoporation als vielversprechende Alternative zu rekombinanten Wachstumsfaktoren in der Geweberegeneration angesehen werden. Die entwickelte Therapie könnte die Behandlung von Knochendefekten revolutionieren, wenn die Gentransfereffizienz gesteigert und somit die Anzahl repetetiver Behandlungen und DNA Dosis reduziert werden kann.

Schlagwörter in Deutsch

Nicht-viral / transient / somatisch / Gentherapie / Sonoporation / Tissue Engineering / Bone Morphogenetic Protein / Heterodimer / Osteoinduktion / Frakturheilung / TetON / induzierbar / Co-Expression

Item Type: Hochschulschrift (Dissertation)
Author: Feichtinger, Georg Alexander
Title: Non-viral transient gene therapy for bone regeneration
Umfangsangabe: 204 S. : Ill., graph. Darst.
Institution: University of Vienna
Faculty: Zentrum für Molekulare Biologie
Publication year: 2012
Language: eng ... Englisch
Supervisor: Redl, Heinz
Assessor: McHale, Anthony
2. Assessor: Gruber, Reinhard
Classification: 44 Medizin > 44.83 Rheumatologie, Orthopädie
44 Medizin > 44.52 Therapie
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie
42 Biologie > 42.15 Zellbiologie
30 Naturwissenschaften allgemein > 30.03 Methoden und Techniken in den Naturwissenschaften
AC Number: AC10847667
Item ID: 26731
(Das PDF-Layout ist ident mit der Druckausgabe der Hochschulschrift.)

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