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Artificial receptors for membrane glycoproteins

Wangchareansak, Thipvaree (2011) Artificial receptors for membrane glycoproteins.
Dissertation, Universität Wien. Fakultät für Chemie
BetreuerIn: Lieberzeit, Peter

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URN: urn:nbn:at:at-ubw:1-29381.80536.445754-4
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Abstract in Englisch

Wheat germ agglutinin (WGA) is a plant lectin that plays a crucial role in biotechnology and biosensors as it interacts with viruses, cells during infection events and also with oligosaccharides that are normally found on cell surfaces of several organisms. Therefore, it is an interesting analyte for mass sensitive sensing in terms of recognition and interaction phenomena. Within this work, WGA was selectively detected by two different techniques including immobilized carbohydrates and molecularly imprinted polymers (MIP) used as recognition elements on quartz crystal microbalance (QCM). Scanning tunneling microscopy (STM) was used to study the surfaces generated by those techniques. As STM requires a conductive surface, gold was sputtered onto the polymer for generating the STM image. Thus cavities having the dimension of WGA dimer could be observed in the resulting molecularly imprinted polymers (MIP). In the case of immobilized receptor analogues, N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc) modified with p-nitrophenol-cysteine was immobilizated on gold for construction of the sensitive layer. Due to the size of WGA molecules, a self-assembled monolayer of GlcNAc is unsuitable for binding as enough space is needed between binding sites to achieve optimal results. Therefore, cysteine molecules were used as spacers between each GlcNAc. Sensor characteristics reveal that the frequency decreased only by -30 Hz if pure GlcNAc is immobilized, which changed to roundly -210 Hz for the mixed surface layer at 160 µg/ml of WGA which in factor of 7. Furthermore, the maximum adsorption layer at the high concentration of WGA is nearly a monolayer (0.98 layers). Therefore, the binding constant was calculated with the Langmuir model. In parallel, WGA was used as the template for molecular imprinting in methacrylate co-polymer system. The sensor characteristics were recorded from 160 µg/ml to 1 µg/ml of WGA. In contrast to this, the adsorption behavior of WGA on the MIP surface occurred in multilayers starting from low concentrations (1 µg/ml). The studies on the WGA–MIP adsorption behavior suggest that the MIP itself works as a “crystallizing nucleus” for the protein, even though the nonimprinted material disfavors WGA adsorption. This can be seen by the fact that up to 25 molecular layers of protein are deposited on the MIP in the observed concentration range, whereas the NIP coated electrodes yield positive frequency shifts indicating anti-Sauerbrey behavior. In terms of adsorption investigation, the BET isotherm was applied to MIP for evaluating the binding properties of WGA due to this multilayer adsorption. Even though the interaction of WGA on glycoside surface is the multivalent interaction but the adsorption layer is occurred only monolayer adsorption leads to applying of Langmuir adsorption model. In comparison, the MIP method shows a substantially higher sensitivity (-1320 Hz for 160 µg/ml) than the immobilized receptor analogue (-210 Hz for 160 µg/ml). In terms of selectivity towards bovine serum albumin (BSA), the MIP has lower selectivity which reaches a factor of ~3 than the artificial receptor yields ~7. Therefore, this investigation indicated that the carbohydrate is better than the MIP in term of selectivity whereas MIP yields higher than artificial receptor for sensitivity.

Schlagwörter in Englisch

WGA lectin / molecularly imprinted polymer / glycosidic receptor / quartz crystal microbalance / sensor

Abstract in Deutsch

Bei Wheat germ agglutinin (WGA) handelt es sich um ein Pflanzenlektin, das eine grundlegende Rolle in der Biotechnologie und er Biosensorik spielt, weil es mit Viren und Zellen im Zuge von Infektionsvorgängen ebenso reagiert, wie mit Oligosaccharieden, die auf den Zelloberflächen verschiedener Organismen vorhanden sind. Daher ist WGA auch interessanter Analyt für massensensitive Messungen, die Einblicke in die Erkennung und die ihr zugrundeliegenden Wechselwirkungen gestatten. Im Zuge dieser Arbeit wurden zwei verschiedene Rezeptorstrategien zur Sensorik von WGA mittels Quarzmikrowaage (quartz crystal microbalance – QCM) entwickelt, nämlich die Immobilisierung glykosidischer Rezeptoranaloga sowie molekular geprägte Polymer (molecularly imprinted polymers – MIP). Die entsprechenden Oberflächen wurden auch mittels Rastertunnelmikroskopie charakterisiert. Da diese Technik leitende Oberflächen benötigt, wurden auf die MIP Goldschichten durch Sputtering aufgebracht. Dadurch war es möglich tatsächlich Kavitäten in der Größe von WGA-Dimeren auf der Oberfläche zu visualisieren. Als Rezeptoranalogon wurde mit p-Nitrophenol und dann Cystein modifiziertes N-Acetyl-D-Glucosamin verwendet und über die SH-Gruppe des Cysteins auf Goldoberflächen immobilisiert. Aufgrund der Größe der Analytmoleküle erwies sich die Beschichtung mit einer kompletten Monolage des Rezeptors nicht als zielführend, da die Bindung dann sterisch behindert wurde. Deswegen mußten Cysteinmoleküle co-immobilisiert werden, um genügenden Abstand zwischen den Glykosiden sicherzustellen: auf der Monolage konnte führte eine Lösung mit 160µg/ml WGA auf der QCM nur zu einer Frequenzantwort von -30Hz, wogegen im Fall der Co-Immobilisierung -210 Hz, also das Siebenfache, erreicht werden konnten. Diese – für die vorliegende Studie maximale – Lösungskonzentration führt zu einer fast kompletten Monolage von WGA (0,98 Monolagen) auf der Sensoroberfläche. Daher lassen sich die Bindungskonstanten mittels eines Langmuir-Modells berechnen. Dazu wurde die Sensorcharakteristik in einem Konzentrationsbereich von 1 µg/ml bis 160 µg/ml aufgenommen. Im Gegensatz dazu adsorbieren MIP bereits bei niedrigen Lösungskonzentrationen (1 µg/ml) bereits Multilayer von WGA, womit ein modifiziertes BET-Modell für die Charakterisierung der Adsorptionsotherme herangezogen wurde. Das Adsorptionsverhalten legt den Schluß nahe, daß das MIP als „Kristallisationskeim“ für das Protein fungiert, obwohl das nichtgeprägte Material die Adsorption nicht begünstigt. Dies ist insbesondere auch daran zu bemerken, daß bis zu 25 Molekullagen auf dem MIP adsorbieren, wogegen die jeweiligen ungeprägten Referenzelektroden positive Frequenzantworten und damit Anti-Sauerbrey-Verhalten zeigen. Beim glykosidischen Rezeptoranalogon wird dagegen trotz maximal eine Monolage durch die Sensorschicht geboten, obwohl ein WGA-Molekül mehrere Bindungsstellen hat. Damit läßt sich dessen Verhalten durch eine Langmuir-Isotherme beschreiben. Im Vergleich der beiden Methoden lassen sich auf den MIP wesentlich höhere Sensoreffekt erzielen: beispielsweise bei 160µg/ml WGA sind es -1320 Hz im Vergleich zu -210 Hz für den Rezeptor. Die Selektivität gegenüber Bovinem Serumalbumin (BSA) ist dagegen mit eine Selektivitätsfaktor von drei im Fall des MIP niedriger, als für da Glykosid, das sieben erreicht. Daher ist bei diesem also die Selektivität besser, die Sensitivität dagegen geringer, als beim MIP.

Schlagwörter in Deutsch

WGA Lektin / molekular geprägtes Polymer / Glykosidrezeptor / Quarzmikrowaage / Sensorik

Dokumentenart: Hochschulschrift (Dissertation)
AutorIn: Wangchareansak, Thipvaree
Titel: Artificial receptors for membrane glycoproteins
Untertitel: comparing systems derived from nature with imprinted polymers
Umfangsangabe: 120 S. : graph. Darst.
Institution: Universität Wien
Fakultät: Fakultät für Chemie
Publikationsjahr: 2011
Sprache: eng ... Englisch
BetreuerIn: Lieberzeit, Peter
BeurteilerIn: Piletsky, Sergey
2. BeurteilerIn: Friedbacher, Gernot
Klassifikation: 35 Chemie > 35.39 Analytische Chemie: Sonstiges
AC-Nummer: AC08925721
Dokumenten-ID: 17085
(Das PDF-Layout ist ident mit der Druckausgabe der Hochschulschrift.)

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