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Cellular accumulation and DNA interaction studies of antitumor metal complexes

Bartel, Caroline (2011) Cellular accumulation and DNA interaction studies of antitumor metal complexes.
Dissertation, Universität Wien. Fakultät für Chemie
BetreuerIn: Keppler, Bernhard

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URN: urn:nbn:at:at-ubw:1-30004.42751.180161-8
URN: urn:nbn:at:at-ubw:1-30004.42751.180161-8

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Abstract in Englisch

The limitations of clinically used platinum-based anticancer drugs in a variety of solid tumors, severe side effects and the problem of acquired and intrinsic resistance necessitate the development of anticancer therapeutics with a different mode of action. Hence, within this PhD thesis the ruthenium based investigational anticancer drug KP1019 which showed promising results in a phase I clinical trial was investigated with regard to its mode of action. Based on the ‘activation by reduction’ hypothesis, the influence of the intracellular antioxidant ascorbic acid (vitamin C) was studied. Ascorbic acid enhanced the activity of KP1019 which was shown by higher cytotoxicity in the human colon carcinoma cell line SW480, human cervical carcinoma KB-3-1 cells, and the multidrug-resistant subline KBC-1. Moreover it was demonstrated by means of EMSA that ascorbic acid enhanced interaction of KP1019 with the model biomolecule plasmid DNA. To explain increased activity, cellular accumulation was investigated and ruthenium contents were measured by ICP-MS. Those studies revealed that ascorbic acid did not alter the intracellular ruthenium concentration compared to KP1019-only treated cells. During incubation with KP1019 intracellular reactive oxygen species (ROS) are produced. To elucidate whether generation of ROS is influenced by ascorbic acid and therefore may contribute to the enhanced cytotoxic potential of KP1019, ROS were analyzed by the DCFA-DH assay and subsequent FACS measurements. It was evinced that KP1019-induced ROS were reduced by ascorbic acid in a dose-dependent manner and thus can be excluded as a reason for increased activity of KP1019. Based on the obtained results, it is assumed that the direct interaction of KP1019 and ascorbic acid, resulting in reduction of the ruthenium center, is responsible for the enhanced reactivity. A further scope was investigation of non-classic platinum drugs with regard to their biological behavior. Therefore three pairs of cis and trans configured platinum(II)-acetone oxime complexes and one pair of 3-pentanone oxime platinum(II) complexes, which displayed higher cytotoxicity for the trans configured complexes than their cis configured counterparts and proved more cytotoxic than cisplatin in the inherently cisplatin resistant cell line SW480, were selected. To explain the higher activity, cellular accumulation was determined, revealing enhanced concentrations in cells treated with the four trans platinum(II) complexes compared to the respective cis complexes as well as cisplatin and transplatin. Based on the assumption that DNA is the critical cellular target as it is with cisplatin, binding to DNA was investigated by in vitro DNA metalation experiments and determined by ICP-MS measurement. Again, the trans complexes showed stronger effects resulting in higher rb values (platinum per phosphorus). Studies on the genotoxic potential of the trans platinum(II) complexes as well as their ability to induce cross-links were conducted by means of the Comet Assay and showed a distinct impact on the DNA compared to cisplatin. Additional information about the type of DNA interaction were obtained by cell free experiments with plasmid DNA and the nucleobase GMP which, in accordance with the other experiments, also indicated differences compared to cisplatin. The variations in DNA interactions between the novel trans platinum(II) complexes and cisplatin give reason to think of a different mode of action. Concluding, the presented investigations of cellular accumulation and interaction with biomolecules of metal based anticancer drugs contribute to the understanding of the mode of action of those complexes. The emphasis for further clinical development is on substances that act differently from currently used drugs because such complexes may overcome resistance phenomena or bear a lower risk of severe side effects.

Schlagwörter in Englisch

platinum complexes / antitumor therapeutics / cellular accumulation / DNA interactions / ruthenium complexes

Abstract in Deutsch

Die unzureichende Wirkung platin-basierter Krebstherapeutika in einer Vielzahl solider Tumore, die schweren Nebenwirkungen und das Problem von erworbener und intrinsischer Resistenz machen die Entwicklung von Arzneimitteln mit einem anderen Wirkmechanismus notwendig. Ein Schwerpunkt dieser Arbeit war daher die Untersuchung der Wirkungsweise des Ruthenium-Komplexes KP1019, der bereits in einer klinischen Phase I – Studie erfolgversprechende Resultate erzielte. Basierend auf der Hypothese einer Aktivierung durch Reduktion wurde der Einfluss des intrazellulären Antioxidans Ascorbinsäure (Vitamin C) untersucht. Ascorbinsäure verstärkte die Aktivität von KP1019, was sich durch höhere Zytotoxizität in der humanen Darmkrebszelllinie SW480, den humanen Gebärmutterkarzinomzellen KB-3-1 und der mehrfach resistenten Subzelllinie KBC-1 gezeigt hat. Darüberhinaus konnte in weiteren Versuchen unter dem Einfluss von Ascorbinsäure eine verstärkte Reaktivität von KP1019 mit dem Modell-Biomolekül Plasmid-DNA mittels EMSA nachgewiesen werden. Um die erhöhte Aktivität erklären zu können, wurde zunächst die zelluläre Akkumulation untersucht und der Ruthenium-Gehalt der Zellen mittels ICP-MS bestimmt. Dabei zeigte sich, dass Ascorbinsäure die intrazelluläre Ruthenium-Konzentration im Vergleich zu Zellen, die nur mit KP1019 behandelt wurden, nicht veränderte. Bei der Inkubation mit KP1019 kommt es zur Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), die bei der zytotoxischen Wirkung eine Rolle spielen. Die Frage, ob die ROS-Bildung durch Ascorbinsäure beeinflusst wird und damit zur Erklärung der erhöhten zytotoxischen Wirkung von KP1019 beitragen kann, wurde durch den DCFA-DH Assay mit anschließender FACS Messung untersucht. Es zeigte sich, dass der Gehalt an durch KP1019 gebildete ROS durch Ko-Inkubation mit Ascorbinsäure dosisabhängig abnimmt und somit als Ursache der verstärkten Aktivität von KP1019 ausgeschlossen werden kann. Basierend auf den Resultaten wird angenommen, dass eine direkte Wechselwirkung zwischen KP1019 und Ascorbinsäure und die daraus resultierende Reduktion des Ruthenium-Zentrums für die verstärkte Reaktivität verantwortlich ist. Eine weitere Aufgabenstellung war die Untersuchung biologischer Effekte nicht-klassischer Platinverbindungen. Hierzu wurden drei Paare cis- und trans- konfigurierter Platin(II)-Acetonoxim-Komplexe und ein Paar Platin(II)-Pentanonoxim-Komplexe ausgewählt, bei denen die trans-Komplexe deutlich zytotoxischer als ihre cis-konfigurierten Analoga wirken und vor allem in der cisplatin-resistenten Zelllinie SW480 aktiver als Cisplatin sind. Um die stärkere Aktivität erklären zu können, wurde zunächst die zelluläre Akkumulation gemessen. Dabei konnte eine erhöhte zelluläre Anreicherung im Falle der vier trans-Platin(II)-Komplexe im Vergleich zu den entsprechenden cis-Komplexen sowie zu Cisplatin und Transplatin nachgewiesen werden. Aufgrund der Annahme dass DNA, wie bei Cisplatin, das zelluläre Target ist, wurde die Anbindung an die DNA in Zellen untersucht und mittels ICP-MS gemessen. Auch hier zeigten die trans-Komplexe stärkere Effekte, die in höheren rb-Werten (Platin pro Phosphor) resultierte. Untersuchungen des genotoxischen Potenzials der trans-Platin(II)-Komplexe und die Fähigkeit der Verbindungen, Quervernetzungen zu verursachen, wurden mit Hilfe des Comet Assays durchgeführt und zeigten eine von Cisplatin deutlich abweichende Wirkung auf die DNA. Zusätzliche Informationen über die Art der DNA-Wechselwirkung brachten zellfreie Experimente mit Plasmid-DNA und der Nukleobase GMP, die in Übereinstimmung mit den zuvor erwähnten Versuchen eindeutige Unterschiede zu Cisplatin belegen. Die Abweichungen der DNA-Wechselwirkung der neuen trans-Platin(II)-Komplexe und Cisplatin lassen auf andersartige Wirkmechanismen schließen. Zusammenfassend ist zu erwähnen, dass die vorliegenden Studien der zellulären Akkumulation von metall-basierten Krebstherapeutika und deren Wechselwirkung mit Biomolekülen zum Verständnis des Wirkmechanismus beitragen. Der Fokus der klinischen Weiterentwicklung liegt auf Verbindungen, die anders wirken als derzeit verwendete Medikamente. Solche Wirkstoffe könnten es ermöglichen, Resistenz-Phänomene zu überwinden, oder ein geringeres Risiko ernster Nebenwirkungen aufweisen.

Schlagwörter in Deutsch

Platinverbindungen / Antitumorale Wirkstoffe / Zelluläre Akkumulation / DNA-Interaktionen / Rutheniumverbindungen

Dokumentenart: Hochschulschrift (Dissertation)
AutorIn: Bartel, Caroline
Titel: Cellular accumulation and DNA interaction studies of antitumor metal complexes
Umfangsangabe: 150 S.
Institution: Universität Wien
Fakultät: Fakultät für Chemie
Publikationsjahr: 2011
Sprache: eng ... Englisch
BetreuerIn: Keppler, Bernhard
BeurteilerIn: Dyson, Paul
2. BeurteilerIn: Rompel, Anette
Klassifikation: 35 Chemie > 35.40 Anorganische Chemie: Allgemeines
35 Chemie > 35.71 Biochemische Methoden
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie
35 Chemie > 35.43 Koordinationsverbindungen, Komplexchemie
AC-Nummer: AC08916621
Dokumenten-ID: 16736
(Das PDF-Layout ist ident mit der Druckausgabe der Hochschulschrift.)

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