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Ein neuer Zytotoxizitätstest unter Anwendung humaner, mit EGFP-Expressionskonstrukten transfizierter Tumorzellen und Untersuchung biologischer Effekte von Platinverbindungen

Valiahdi, Seied Mojtaba (2010) Ein neuer Zytotoxizitätstest unter Anwendung humaner, mit EGFP-Expressionskonstrukten transfizierter Tumorzellen und Untersuchung biologischer Effekte von Platinverbindungen.
Dissertation, Universität Wien. Fakultät für Lebenswissenschaften
BetreuerIn: Keppler, Bernhard
Gesperrt bis: 15 Juli 2013
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URN: urn:nbn:at:at-ubw:1-29778.13661.428662-9
URN: urn:nbn:at:at-ubw:1-29778.13661.428662-9

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Abstract in Englisch

The aim of this work is the development of a new cell culture assay by application of four tumor cell lines stably transfected with EGFP (enhanced green fluorescent protein) expression constructs as a screening tool for potential antitumor compounds and to examine whether these in vitro models are suitable to assess the cytotoxicity of various test compounds. Established methods usually employed to study the cytotoxicity of substances are time consuming and require an additional reagent causing a color reaction. Infiltration of the EGFP gene into tumor cells was performed by a chemical transfection procedure (jetPEI). Tumor cells stably expressing EGFP show no change of growth and sensitivity against the anticancer drugs cisplatin and oxaliplatin in comparison to untransfected tumor cells. Generally, stably transfected cells can be selected from untransfected cells by resistance to eucaryote antibiotics, which themselves are cytotoxic and may alter the sensitivity of the cells to test compounds. In order to avoid the use of antibiotics, tumor cells stably expressing EGFP were selected visually by their green fluorescence. In these cells, EGFP expression is under the control of a readily inducible CMV promotor and can be activated by stress factors such as chemotherapeutic agents and UV irradiation. In this model we investigated the response to platinum complexes forming DNA adducts by FACS analysis and a fluorescence reader. The compounds induce an upregulation of EGFP expression at lower concentration, which was additionally verified by Western blotting, and a gradual decrease at higher concentration. Overall, the obtained results suggest a correlation between EGFP response and the cytotoxicity in the MTT assay. Furthermore, structure-activity relationships with respect to antiproliferative effects in human cancer cells in vitro were investigated for a variety of novel platinum compounds: pH-sensitive platinum (II) chelates; alkyl-substituted oxaliplatin derivatives; oxaliplatin analogues containing functionalized glucose; di- and tetracarboxylatoplatinum(IV) complexes; as well as platinum (II) complexes with oxicam and thiocarbamate esters ligands. For pH-sensitive complexes of the general form bis(2-aminoalcoholato-kappa²N,O) platinum(II), the pH-dependence of cytotoxic potency, effects on secondary structure of a circular dsDNA plasmid (pTZ18u), cellular uptake and DNA platination was verified. Immunoblots demonstrating caspase activation and poly- (ADP-ribose) polymerase cleavage indicated the induction of apoptosis in a pHdependent manner. All in-vitro experiments clearly demonstrated a higher activity under slightly acidic conditions. Thus, further studies on the therapeutic applicability of ring-closed platinum(II) alcoholato derivatives in solid tumors are warranted. The cytotoxicity of alkyl-substituted oxaliplatin derivatives was studied in six human cancer cell lines by means of the MTT assay, and the observed structureactivity relationships were compared with therapeutic efficacy in vivo, investigated in the murine L1210 leukemia model. A derivative substituted with an equatorial methyl group in position 4 of the cyclohexane ring was identified as the most promising in vitro and proved to be much more effective in the L1210 model mainly because of higher tolerability. A variety of novel di- and tetracarboxylatoplatinum(IV) derivatives was studied for their antiproliferative activity in four human cancer cell lines (by the MTT Assay) and the DNA platination capacity of selected complexes in a colon carcinoma cell line (by ICP-MS). A high DNA platination capacity of selected platinum(IV) complexes (ester derivatives) compared to cisplatin was observed and suggested a correlation with their antiproliferative activity and vice versa. The in vitro data presented here warrant further studies of these compounds to develop new chemotherapeutic agents for cancer therapy.

Schlagwörter in Englisch

EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein) / Cytotoxicity test / platinum complexes

Abstract in Deutsch

Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, vier stabil EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein) exprimierende Tumorzellinien für Zytotoxizitättests zu etablieren und zu prüfen, ob dieses In-Vitro-Modell zur Abschätzung der Zytotoxizität verschiedenen antitumoraler Testsubstanzen geeignet ist. Die derzeit verbreitetsten Methoden verlangen die Zugabe von Reagenzien, die eine Farbreaktion durchmachen, und sind sehr zeitaufwändig. Die Einschleusung der EGFP-Gene wurde durch chemische Transfektionsmethoden (jetPEI) erzielt. Im Vergleich zu den ursprünglichen Zellinien zeigen stabil transfizierte, EGFP-exprimierende Tumorzellinien keine Veränderung des Wachstumsverhaltens und der Sensivität gegenüber Chemotherapeutika. Üblicherweise wird die Isolierung stabil transfizierter Klone und die Aufrechterhaltung der Reportergene im Genom durch das Vorhandensein von Selektionsgenen, die eine Resistenz gegen eukaryontische Antibiotika vermitteln, erreicht. Diese Antibiotika (Hygromycin, Puromycin,..) sind jedoch selbst zytotoxisch und können mit den Effekten von Testsubstanzen interferieren. Aus diesem Grund wurden die stabil transfizierten Klone durch visuelle Selektion der einzelnen, EGFP-exprimierenden Zellen anhand der grünen Fluoreszenz gewonnen. Die Expression von EGFP wird durch einen leicht induzierbaren CMV-Promotor kontrolliert, welcher durch Stressfaktoren, wie z.B. UV-Bestrahlung oder Chemotherapeutika, aktiviert werden kann. Der Einfluß von Platinverbindungen, die in der Zelle DNA-Addukte formen, auf die Expression von EGFP wurde durch FACS-Analyse und mittels Fluoreszenzphotometer gemessen. Die Verbindungen bewirken in geringeren Konzentrationen eine Hochregulierung der EGFP-Expression und in höheren Konzentrationen eine Abnahme derselben. Insgesamt weisen die erhaltenen Ergebnisse auf eine Korrelation zwischen dem Einfluß auf EGFP und der Zytotoxizität in MTT-Assay hin. Weiters wurden Struktur-Wirkungs-Beziehungen in hinblick auf antiproliferative Effekte in humanen Krebszellen in vitro für eine Vielzahl neuer Platinverbindungen untersucht: pH-sensitive Platin (II) verbindungen, alkyl-substituierte Oxaliplatinderivate, Di- und Tetracarboxylatoplatin(IV) komplexe, endothall-haltige Platin(IV)-Komplexe, Oxaliplatin-Analoga mit funktionalisierten Glucose als Liganden sowie Platin (II)-Komplexe mit Oxicam- und Thiocarbomatesten- Liganden. Für die pH-sensitiven Komplexe der allgemeinen Form Bis(2-aminoalcoholato-kappa²N,O) platin(II) wurde die pH-Abhängigkeit des zytotoxischen Potenzials, der Effekte auf die Sekundärstruktur eines dsDNA-Plasmids (pTZ18u), der zellulären Aufnahme und der DNA-Platinierung experimentell belegt. Außerdem zeigten Immunoblots eine Aktivierung von Caspasen und die Spaltungen von Poly-(ADPribose)- polymerase und belegen somit eine pH-abhängige Induktion von Apoptose. Alle In-vitro-Tests konnten eine deutliche höhere Aktivität unter leicht sauren bedingungen nachweisen. Weitere Studien der alcoholato-Platin(II)- verbindungen an soliden Tumoren sind somit wünschenswert. Die Zytotoxizität alkylsubstituierter Oxaliplatin-Derivate wurde mittels MTT-Assays an sechs humanen Tumorzellinien getestet und die beobachteten Strukture- Wirkung-Beziehungen wurden mit der therapeutischen Wirksamkeit im L1210- Leukämiemodell in der Mause verglichen. Ein Derivat mit äquatorialen Methyl- Substituenten in Position 4 des Cyclohexanrings wurde als das vielversprechendste identifiziert und erwies sich als wirksamer als die Mutterverbindung im L1210-Modell, vor allem aufgrund der höheren Verträglichkeit, die eine höhere Dosierung erlaubt. Eine Vielzahl von neuen Platin(IV)-Komplexen wurde auf ihre antiproliferative Aktivität an vier Tumorzellinien getestet sowie das Ausmaß der DNA-Platinierung an einer Kolonkarzinomzellinie mittels ICP-MS bestimmt. Das hohe DNAPlatinierungspotenzial ausgewählter Platin(IV)-Komplexe (Estherderivate) ist vergleichbar mit Cisplatin und lässt einen Zusammenhang mit der antiproliferativen Aktivität erkennen. Die hier präsentierten In-vitro-Daten rechtfertigen weitere Studien dieser Verbindungen im sinne der Entwicklung neuer Chemotherapeutika für die Krebstheraphie.

Schlagwörter in Deutsch

EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein) / Zytotoxizitättests / Platin verbindungen

Dokumentenart: Hochschulschrift (Dissertation)
AutorIn: Valiahdi, Seied Mojtaba
Titel: Ein neuer Zytotoxizitätstest unter Anwendung humaner, mit EGFP-Expressionskonstrukten transfizierter Tumorzellen und Untersuchung biologischer Effekte von Platinverbindungen
Umfangsangabe: 174 S.
Institution: Universität Wien
Fakultät: Fakultät für Lebenswissenschaften
Publikationsjahr: 2010
Sprache: eng ... Englisch
BetreuerIn: Keppler, Bernhard
BeurteilerIn: Keppler, Bernhard
2. BeurteilerIn: Rompel, Annette
Klassifikation: 30 Naturwissenschaften allgemein > 30.00 Naturwissenschaften allgemein: Allgemeines
42 Biologie > 42.15 Zellbiologie
AC-Nummer: AC08445143
Dokumenten-ID: 12848
(Das PDF-Layout ist ident mit der Druckausgabe der Hochschulschrift.)

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