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Recombinant expression, purification and quaternary structure of human RNase ZS, RNase ZL and tRNA ribonucleotidyl transferase

Samminger, Bernhard Günther (2010) Recombinant expression, purification and quaternary structure of human RNase ZS, RNase ZL and tRNA ribonucleotidyl transferase.
Diplomarbeit, University of Vienna. Fakultät für Lebenswissenschaften
BetreuerIn: Lubitz, Werner

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URN: urn:nbn:at:at-ubw:1-29136.65634.728569-5
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Abstract in English

All tRNAs are transcribed as immature precursors, which have to be processed at the 3’ and at the 5’ end. This diploma thesis is about the enzymes maturating the 3’ end in humans: RNase Z (two isozymes: RNase ZS and RNase ZL) removes extra nucleotides from the 3’ end and tRNA ribonucleotidyl transferase adds and/or repairs the sequence CCA subsequently. Primary objective of this thesis was the recombinant expression of these proteins in Escherichia coli and their purification in order to use them as parts of an in vitro tRNA-processing system so as to study pathogenic mutations of mitochondrial tRNAs. When bacterial expression was achieved, it was optimized to minimize formation of inclusion bodies. As a result, the pET-system (Novagen) was used for expression of C-terminally hexahistidine-tagged versions of all three proteins. RNase ZS and tRNA ribonucleotidyl transferase were expressed via BL21(DE3) at low temperatures (~15°C) over night using 1 mM IPTG for induction and RNase ZL was expressed via Rosetta2(DE3) under the same conditions. Purification of recombinant proteins was done via affinity chromatography using an ÄKTA explorer chromatography system. The procedure was optimized using step gradients of imidazole concentration for loading, washing and elution. Proteins were checked for activity and subsequently stored in buffer containing 50% glycerol at -20°C or frozen at -80°C. Secondary objective was gaining some information on quaternary structure of both RNases Z. Four different methods were used: size exclusion chromatography, glycerol gradient centrifugation, blue native PAGE and chemical cross-linking. RNase ZS seemes to be a homodimer judged by size exclusion chromatography, glycerol gradient centrifugation and chemical cross-linking. The quaternary structure of RNase ZL, on the other hand, is still unclear. Whereas size exclusion chromatography and blue native PAGE suggested a homodimer, glycerol gradient centrifugation appeared to indicate a monomer or a salt-labile homodimer depending on the buffer conditions used. Chemical cross-linking failed.

Schlagwörter in Englisch

RNase Z / tRNA ribonucleotidyl transferase / expression / Escherichia coli / affinity chromatography / size exclusion chromatography / glycerol gradient centrifugation / blue native PAGE / chemical cross-linking

Abstract in German

Alle tRNAs werden als unreife Vorläufer transkribiert, die an ihren 3’- und 5’-Enden prozessiert werden müssen. Diese Diplomarbeit beschäftigt sich mit den Enzymen, die für die Reifung der 3’-Enden beim Menschen zuständig sind: RNase Z (zwei Isozyme: RNase ZS und RNase ZL) entfernt überzählige Nukleotide am 3’-Ende und tRNA-Ribonukleotidyltransferase addiert und/oder repariert anschließend die Sequenz CCA. Primäres Ziel dieser Arbeit war die rekombinante Expression dieser Proteine in Escherichia coli und deren Reinigung, um sie als Teile eines in vitro Prozessierungssystems zur Erforschung pathogener Mutationen von tRNAs zu benutzen. Nach erfolgreicher bakterieller Expression wurde diese optimiert, um die Einschlusskörperbildung zu minimieren. In der Folge wurde das pET-System (Novagen) für die Expression von C-terminal mit einem Hexahistidintag versehenen Versionen aller drei Proteine benutzt. RNase ZS und tRNA-Ribonukleotidyltransferase wurden mittels BL21(DE3) bei niedrigen Temperaturen (~15°C) über Nacht unter Verwendung von 1 mM IPTG zur Induktion exprimiert und RNase ZL wurde mittels Rosetta2(DE3) unter den selben Bedingungen exprimiert. Die Reinigung der rekombinanten Proteine erfolgte per Affinitätschromatographie, wobei ein „ÄKTA explorer“ Chromatographiesystem benutzt wurde. Die Prozedur wurde optimiert mittels Stufengradienten der Imidazolkonzentration für Laden, Waschen und Eluieren. Die Proteine wurden auf Aktivität getestet and anschließend in einem Buffer mit 50% Glycerin auf -20°C oder gefroren auf -80°C gelagert. Sekundäres Ziel war die Erlangung von Information bezüglich der Quartärstruktur beider RNase Z. Vier verschiedene Methoden wurden angewandt: Gelfiltration, Glyceringradientenzentrifugation, blue native PAGE und chemisches Cross-linking. RNase ZS schien ein Homodimer zu sein, wofür Gelfiltration, Glyceringradientenzentrifugation und chemisches Cross-linking sprachen. Im Gegensatz dazu ist die Quartärstruktur von RNase ZL weiterhin unklar. Während Gelfiltration und blue native PAGE ein Homodimer suggerierten, schien die Glyceringradientenzentrifugation ein Monomer oder ein salzlabiles Homodimer zu zeigen abhängig von den verwendeten Bufferbedingungen. Chemisches Cross-linking schlug fehl.

Schlagwörter in Deutsch

RNase Z / tRNA-Ribonukleotidyltransferase / Expression / Escherichia coli / Affinitätschromatographie / Gelfiltration / Glyceringradientenzentrifugation / Blue Native PAGE / chemisches Cross-linking

Item Type: Hochschulschrift (Diplomarbeit)
Author: Samminger, Bernhard Günther
Title: Recombinant expression, purification and quaternary structure of human RNase ZS, RNase ZL and tRNA ribonucleotidyl transferase
Umfangsangabe: 81 S.
Institution: University of Vienna
Faculty: Fakultät für Lebenswissenschaften
Publication year: 2010
Language: eng ... Englisch
Supervisor: Lubitz, Werner
Assessor: Lubitz, Werner
Classification: 42 Biologie > 42.30 Mikrobiologie
AC Number: AC08779424
Item ID: 12042
(Das PDF-Layout ist ident mit der Druckausgabe der Hochschulschrift.)

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