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Virus-like particles of Pseudoalteromonas marina and their possible medical significance

Kappelmann, Melanie (2010) Virus-like particles of Pseudoalteromonas marina and their possible medical significance.
Diplomarbeit, University of Vienna. Fakultät für Lebenswissenschaften
BetreuerIn: Hagemann, Sylvia

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DOI: 10.25365/thesis.11729
URN: urn:nbn:at:at-ubw:1-29953.06050.472870-6

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Abstract in English

Virus- like- particles (VLPs) are membrane vesicles derived from some marine bacteria. They are spontaneously released from specific bacteria during growth. In this study the production of VLPs of Pseudoalteromonas marina was investigated with special focus on the time when particle production starts, the morphology of the particles, their DNA and its functionality. PCR was used for the verification that the cultivated species under investigation is Pseudoalteromonas marina. For such purpose 16S rRNA sequences were used. The actual state of knowledge is that VLPs were generated by -for the most part - unidentified marine bacterial strains, that they contain a large linear DNA molecule (20- 500 kb). Hence, the DNA of those particles was extracted and sequenced to determine the source of the particle DNA (bacterial or viral). Therefore the bacterium Pseudoalteromonas marina was cultivated and the VLPs were isolated by filtration and ultracentrifugation at different bacterial culture ages. Collectively three DNA-fractions had to be extracted: bacterial genomic DNA was isolated to get a PCR-target for the verification of the species (Pseudoalteromonas marina), DNA out of the VLPs was extracted for further analyses and plasmid DNA in order to sequence the cloned VLP-fragments. To prepare VLP–DNA suitable for cloning in order to construct a shot-gun-library the original high molecular weight DNA was mechanically fragmented. Blunt-ends were created necessary for cloning the DNA. The “repaired” DNA was size fractionated and cleaned by agarose gel electrophoresis and eluted from the gel pieces. The achieved, eluted DNA was ligated in an appropriate plasmid vector (pSMART HCKan); for transformation the purchased competent “E.cloni cells” were used. Sequence data were analysed computer- based. Based on the knowledge of recent studies that some marine bacteria are inhibitory to other bacteria, thus playing an important role in marine ecology, the antibacterial activity of Pseudoalteromonas marina and derived particles was tested. Therefore a disc- diffusion assay was conducted. Additionally, as producers of antibacterial compounds they were thought to be of high medical relevance, especially considering the rapid increase and spread of antibiotic-resistant bacteria. Because of this rapid increase over the past decade, there is an urgent need to discover novel antimicrobial compounds.

Schlagwörter in Englisch

Pseudoalteromonas marina / virus- like- particles / antibacterial activity

Abstract in German

Virus- like- particles (VLPs) sind Membranvesikel welche von einigen marinen Bakterien spontan während des bakteriellen Wachstums abgegeben werden. In dieser Arbeit wurde die VLP- Produktion des Bakteriums Pseudoalteromonas marina mit besonderem Augenmerk auf den Beginn der Partikelproduktion, die Morphologie der Partikel sowie die beinhaltende DNA und ihre Funktionalität untersucht. Zur Verifizierung des Bakteriums Pseudoalteromonas marina wurde die Polymerasekettenreaktion basierend auf der 16S rRNA durchgeführt. Der aktuelle Wissensstand bezüglich der VLPs ist, dass sie in den meisten Fällen von noch nichtidentifizierten marinen Bakterien produziert werden und eine hochmolekulare DNA (20- 500 kb) beinhalten. Demnach wurde die VLP- DNA aus den Partikeln extrahiert und sequenziert, um herauszufinden ob diese bakteriellen oder viralen Ursprungs ist. Zu diesem Zwecke wurde das Bakterium Pseudoalteromonas marina kultiviert, um dann aus verschiedenen Wachstumsstadien VLPs durch Filtration und Ultrazentrifugation zu isolieren. Insgesamt wurden drei verschiedene DNA Extraktionen durchgeführt: bakterielle genomische DNA, um durch PCR die Spezies Pseudoalteromonas marina zu verifizieren, VLP- DNA zum Zwecke weiterer Analysen und Plasmid- DNA, um die klonierten VLP- DNA Fragmente zu sequenzieren. Die hoch molekulare VLP- DNA wurde für die Klonierung und Herstellung einer Shotgun- library mechanisch fragmentiert. Ebenfalls notwendig für eine erfolgreiche Klonierung war das Erzeugen von Blunt- ends der fragmentierten VLP- DNA. Die VLP- DNA wurde anschießend durch Agarose- Gelelektrophorese der Größe nach fraktioniert und gereinigt. Im Anschluss wurden die entsprechenden Gelstücke eluiert, die eluierte DNA in einen entsprechenden Vektor (pSMART HCKan) ligiert und in kompetente „E. cloni Zellen“ transformiert. Die Sequenzdaten wurden computergestützt analysiert. Basierend auf dem Wissen, dass einige marine Bakterien inhibitorisch auf andere Bakterien wirken und somit eine wichtige Funktion in marinen Ökosystemen haben, wurde das Bakterium Pseudoalteromonas marina und die von ihm produzierten VLPs auf eine mögliche antibakterielle Aktivität hin untersucht. Zu diesem Zwecke wurde ein disc- diffussion- assay durchgeführt. Als Produzent von antibakteriell wirkenden Substanzen 101 würde dieser Spezies eine hohe medizinische Relevanz zugesprochen werden, insbesondere unter Berücksichtigung der ständig ansteigenden Diversität Antibiotika resistenter Bakterien. Aufgrund dieses schnellen Anstiegs innerhalb des letzten Jahrzehntes ist es von äußester Dringlichkeit neue antimikrobiell wirkende Substanzen zu entdecken.

Schlagwörter in Deutsch

Pseudoalteromonas marina / "Virus- like- Particles" / antibakterielle Aktivität

Item Type: Hochschulschrift (Diplomarbeit)
Author: Kappelmann, Melanie
Title: Virus-like particles of Pseudoalteromonas marina and their possible medical significance
Umfangsangabe: 102 S.
Institution: University of Vienna
Faculty: Fakultät für Lebenswissenschaften
Publication year: 2010
Language: eng ... Englisch
Supervisor: Hagemann, Sylvia
Assessor: Hagemann, Sylvia
Classification: 42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie
42 Biologie > 42.30 Mikrobiologie
AC Number: AC08392779
Item ID: 11729
(Das PDF-Layout ist ident mit der Druckausgabe der Hochschulschrift.)

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